ناهمگونی فیبرهای عضله اسکلتی انسان فراتر از زنجیره سنگین میوزین

از بازدید شما از nature.com متشکریم. نسخه مرورگری که استفاده می‌کنید پشتیبانی محدودی از CSS دارد. برای بهترین تجربه، توصیه می‌کنیم از آخرین نسخه مرورگر استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در Internet Explorer غیرفعال کنید). علاوه بر این، برای اطمینان از پشتیبانی مداوم، این سایت عاری از استایل‌ها و جاوا اسکریپت خواهد بود.
عضله اسکلتی یک بافت ناهمگن است که عمدتاً از میوفیبریل‌ها تشکیل شده است، که در انسان معمولاً به سه نوع طبقه‌بندی می‌شوند: یک نوع «کند» (نوع ۱) و دو نوع «تند» (نوع ۲A و ۲X). با این حال، ناهمگونی بین و درون انواع سنتی میوفیبریل هنوز به خوبی شناخته نشده است. ما رویکردهای ترانسکریپتومیک و پروتئومیک را به ترتیب بر روی ۱۰۵۰ و ۱۰۳۸ میوفیبریل منفرد از عضله پهن خارجی انسان اعمال کردیم. مطالعه پروتئومیک شامل مردان و مطالعه ترانسکریپتومیک شامل ۱۰ مرد و ۲ زن بود. علاوه بر ایزوفرم‌های زنجیره سنگین میوزین، پروتئین‌های متابولیک، پروتئین‌های ریبوزومی و پروتئین‌های اتصالی سلولی را به عنوان منابع تنوع بین میوفیبریل چند بعدی شناسایی کردیم. علاوه بر این، با وجود شناسایی خوشه‌های فیبرهای کند و سریع، داده‌های ما نشان می‌دهد که فیبرهای نوع ۲X از نظر فنوتیپی از سایر فیبرهای تند انقباض قابل تشخیص نیستند. علاوه بر این، طبقه‌بندی مبتنی بر زنجیره سنگین میوزین برای توصیف فنوتیپ میوفیبر در میوپاتی‌های نمالین کافی نیست. به طور کلی، داده‌های ما ناهمگونی میوفیبر چندبعدی را نشان می‌دهند، که منابع تنوع فراتر از ایزوفرم‌های زنجیره سنگین میوزین است.
ناهمگونی سلولی یک ویژگی ذاتی همه سیستم‌های بیولوژیکی است که به سلول‌ها اجازه می‌دهد تا برای برآوردن نیازهای مختلف بافت‌ها و سلول‌ها تخصص یابند.1 دیدگاه سنتی در مورد ناهمگونی فیبر عضله اسکلتی این بوده است که نورون‌های حرکتی نوع فیبر را در یک واحد حرکتی تعریف می‌کنند و نوع فیبر (یعنی نوع 1، نوع 2A و نوع 2X در انسان) توسط ویژگی‌های ایزوفرم‌های زنجیره سنگین میوزین (MYH) تعیین می‌شود.2 این در ابتدا بر اساس ناپایداری pH ATPase آنها،3،4 و بعداً بر اساس بیان مولکولی MYH آنها بود.5 با این حال، با شناسایی و پذیرش بعدی فیبرهای "مختلط" که MYH های متعددی را با نسبت‌های مختلف بیان می‌کنند، فیبرهای عضله اسکلتی به طور فزاینده‌ای به عنوان یک پیوستار به جای انواع فیبر مجزا در نظر گرفته می‌شوند.6 با وجود این، این حوزه هنوز هم به شدت به MYH به عنوان طبقه‌بندی کننده اصلی برای طبقه‌بندی میوفیبر متکی است، دیدگاهی که احتمالاً تحت تأثیر محدودیت‌ها و سوگیری‌های قابل توجه مطالعات اولیه جوندگان است که پروفایل‌های بیان MYH و طیف انواع فیبر آنها با انسان متفاوت است.2 این وضعیت با این واقعیت که عضلات اسکلتی مختلف انسان طیف متنوعی از انواع فیبرها را نشان می‌دهند.7 عضله پهن خارجی یک عضله مختلط با پروفایل بیان MYH متوسط ​​(و بنابراین نماینده) است.7 علاوه بر این، سهولت نمونه‌برداری آن، آن را به بهترین عضله مورد مطالعه در انسان تبدیل کرده است.
بنابراین، بررسی بی‌طرفانه تنوع فیبرهای عضلانی اسکلتی با استفاده از ابزارهای قدرتمند "omics" بسیار مهم اما در عین حال چالش‌برانگیز است، که بخشی از آن به دلیل ماهیت چند هسته‌ای فیبرهای عضلانی اسکلتی است. با این حال، فناوری‌های transcriptomics8،9 و proteomics10 در سال‌های اخیر به دلیل پیشرفت‌های مختلف فناوری، انقلابی در حساسیت داشته‌اند و امکان تجزیه و تحلیل عضله اسکلتی را با وضوح تک فیبر فراهم کرده‌اند. در نتیجه، پیشرفت قابل توجهی در توصیف تنوع تک فیبری و پاسخ آنها به محرک‌های آتروفیک و پیری حاصل شده است.11،12،13،14،15،16،17،18. نکته مهم این است که این پیشرفت‌های فناوری کاربردهای بالینی دارند و امکان توصیف دقیق‌تر و جزئی‌تر اختلال تنظیم مرتبط با بیماری را فراهم می‌کنند. به عنوان مثال، پاتوفیزیولوژی میوپاتی نمالین، یکی از شایع‌ترین بیماری‌های ارثی عضلانی (MIM 605355 و MIM 161800)، پیچیده و گیج‌کننده است.19،20 بنابراین، توصیف بهتر اختلال تنظیم فیبرهای عضلانی اسکلتی می‌تواند منجر به پیشرفت‌های قابل توجهی در درک ما از این بیماری شود.
ما روش‌هایی را برای تجزیه و تحلیل ترانسکریپتومیک و پروتئومیک فیبرهای عضلانی اسکلتی منفرد که به صورت دستی از نمونه‌های بیوپسی انسانی جدا شده بودند، توسعه دادیم و آنها را بر روی هزاران فیبر اعمال کردیم که به ما امکان بررسی ناهمگونی سلولی فیبرهای عضلانی اسکلتی انسان را می‌دهد. در جریان این کار، ما قدرت فنوتیپ‌بندی ترانسکریپتومیک و پروتئومیک فیبرهای عضلانی را نشان دادیم و پروتئین‌های متابولیک، ریبوزومی و اتصالی سلولی را به عنوان منابع قابل توجه تغییرپذیری بین فیبری شناسایی کردیم. علاوه بر این، با استفاده از این گردش کار پروتئومیک، ارتباط بالینی میوپاتی نماتد را در فیبرهای عضلانی اسکلتی منفرد مشخص کردیم و یک تغییر هماهنگ به سمت فیبرهای غیر اکسیداتیو مستقل از نوع فیبر بر اساس MYH را آشکار کردیم.
برای بررسی ناهمگونی فیبرهای عضله اسکلتی انسان، ما دو گردش کار را برای امکان تجزیه و تحلیل ترانسکریپتوم و پروتئوم فیبرهای عضله اسکلتی منفرد توسعه دادیم (شکل 1A و شکل تکمیلی 1A). ما چندین مرحله روش‌شناختی را توسعه داده و بهینه کردیم، از ذخیره‌سازی نمونه و حفظ یکپارچگی RNA و پروتئین گرفته تا بهینه‌سازی توان عملیاتی برای هر رویکرد. برای تجزیه و تحلیل ترانسکریپتوم، این کار با قرار دادن بارکدهای مولکولی خاص نمونه در مرحله اولیه رونویسی معکوس انجام شد که امکان جمع‌آوری 96 فیبر را برای پردازش کارآمد در پایین‌دست فراهم می‌کرد. توالی‌یابی عمیق‌تر (±1 میلیون خوانش در هر فیبر) در مقایسه با رویکردهای تک سلولی سنتی، داده‌های ترانسکریپتوم را غنی‌تر کرد.21 برای پروتئومیکس، ما از یک گرادیان کروماتوگرافی کوتاه (21 دقیقه) همراه با جمع‌آوری داده‌های DIA-PASEF در طیف‌سنج جرمی timsTOF استفاده کردیم تا عمق پروتئوم را بهینه کنیم و در عین حال توان عملیاتی بالا را حفظ کنیم. 22،23 برای بررسی ناهمگونی فیبرهای عضله اسکلتی سالم، ما رونوشت‌های 1050 فیبر منفرد از 14 اهداکننده بالغ سالم و پروتئوم‌های 1038 فیبر از 5 اهداکننده بالغ سالم را مشخص کردیم (جدول تکمیلی 1). در این مقاله، این مجموعه داده‌ها به ترتیب به عنوان رونوشت‌های 1000 فیبری و پروتئوم‌ها نامیده می‌شوند. رویکرد ما در مجموع 27237 رونوشت و 2983 پروتئین را در آنالیزهای رونوشت‌شناسی و پروتئوم‌شناسی 1000 فیبری شناسایی کرد (شکل 1A، مجموعه داده‌های تکمیلی 1-2). پس از فیلتر کردن مجموعه داده‌های رونوشت‌شناسی و پروتئوم‌شناسی برای بیش از 1000 ژن شناسایی شده و 50٪ مقادیر معتبر در هر فیبر، آنالیزهای بیوانفورماتیک بعدی به ترتیب برای 925 و 974 فیبر در رونوشت‌شناسی و پروتئوم انجام شد. پس از فیلتر کردن، به طور متوسط ​​۴۲۵۷ ± ۱۵۵۷ ژن و ۲۰۱۵ ± ۲۳۴ پروتئین (میانگین ± انحراف معیار) در هر فیبر شناسایی شد، با تنوع محدود بین فردی (شکل‌های تکمیلی ۱B-C، مجموعه داده‌های تکمیلی ۳-۴). با این حال، تنوع درون فردی در بین شرکت‌کنندگان برجسته‌تر بود، احتمالاً به دلیل تفاوت در بازده RNA/پروتئین بین فیبرهای با طول‌ها و سطوح مقطع مختلف. برای اکثر پروتئین‌ها (>۲۰۰۰)، ضریب تغییرات کمتر از ۲۰٪ بود (شکل تکمیلی ۱D). هر دو روش امکان ثبت طیف وسیعی از رونوشت‌ها و پروتئین‌ها با امضاهای بسیار بیان‌شده مهم برای انقباض عضله (به عنوان مثال، ACTA1، MYH2، MYH7، TNNT1، TNNT3) را فراهم کردند (شکل‌های تکمیلی ۱E-F). بیشتر ویژگی‌های شناسایی‌شده بین مجموعه داده‌های ترانسکریپتومیک و پروتئومیک مشترک بودند (شکل تکمیلی 1G) و میانگین شدت UMI/LFQ این ویژگی‌ها همبستگی نسبتاً خوبی داشتند (r = 0.52) (شکل تکمیلی 1H).
گردش کار ترانسکریپتومیکس و پروتئومیکس (ایجاد شده با BioRender.com). منحنی‌های دامنه دینامیکی BD برای MYH7، MYH2 و MYH1 و آستانه‌های محاسبه شده برای تعیین نوع فیبر. E، F توزیع بیان MYH در سراسر فیبرها در مجموعه داده‌های ترانسکریپتومیکس و پروتئومیکس. G، H نمودارهای تقریب و تصویر تنوع یکنواخت (UMAP) برای ترانسکریپتومیکس و پروتئومیکس که بر اساس نوع فیبر مبتنی بر MYH رنگ‌آمیزی شده‌اند. I، J نمودارهای ویژگی که بیان MYH7، MYH2 و MYH1 را در مجموعه داده‌های ترانسکریپتومیکس و پروتئومیکس نشان می‌دهند.
ما در ابتدا با استفاده از یک رویکرد بهینه‌شده که از حساسیت بالا و محدوده دینامیکی بیان MYH در مجموعه داده‌های اومیکس بهره می‌برد، نوع فیبر مبتنی بر MYH را به هر فیبر اختصاص دادیم. مطالعات قبلی از آستانه‌های دلخواه برای برچسب‌گذاری فیبرها به عنوان نوع خالص 1، نوع 2A، نوع 2X یا مختلط بر اساس درصد ثابتی از بیان MYHهای مختلف استفاده کرده‌اند11،14،24. ما از رویکرد متفاوتی استفاده کردیم که در آن بیان هر فیبر توسط MYHهایی که برای تایپ فیبرها استفاده کردیم، رتبه‌بندی شد: MYH7، MYH2 و MYH1، که به ترتیب مربوط به فیبرهای نوع 1، نوع 2A و نوع 2X هستند. سپس نقطه عطف پایینی هر منحنی حاصل را به صورت ریاضی محاسبه کردیم و از آن به عنوان آستانه‌ای برای اختصاص فیبرها به عنوان مثبت (بالاتر از آستانه) یا منفی (پایین‌تر از آستانه) برای هر MYH استفاده کردیم (شکل 1B-D). این داده‌ها نشان می‌دهند که MYH7 (شکل 1B) و MYH2 (شکل 1C) در مقایسه با سطح پروتئین، پروفایل‌های بیان روشن/خاموش متمایزتری در سطح RNA دارند. در واقع، در سطح پروتئین، تعداد بسیار کمی از فیبرها MYH7 را بیان نکردند و هیچ فیبری 100٪ بیان MYH2 نداشت. در مرحله بعد، از آستانه‌های بیان از پیش تعیین‌شده برای اختصاص انواع فیبرهای مبتنی بر MYH به همه فیبرها در هر مجموعه داده استفاده کردیم. به عنوان مثال، فیبرهای MYH7+/MYH2-/MYH1- به نوع 1 اختصاص داده شدند، در حالی که فیبرهای MYH7-/MYH2+/MYH1+ به نوع مختلط 2A/2X اختصاص داده شدند (برای توضیحات کامل به جدول تکمیلی 2 مراجعه کنید). با جمع کردن همه فیبرها، توزیع بسیار مشابهی از انواع فیبرهای مبتنی بر MYH را در هر دو سطح RNA (شکل 1E) و پروتئین (شکل 1F) مشاهده کردیم، در حالی که ترکیب نسبی انواع فیبرهای مبتنی بر MYH در افراد مختلف، همانطور که انتظار می‌رفت، متفاوت بود (شکل تکمیلی 2A). بیشتر فیبرها به عنوان نوع خالص ۱ (۳۴-۳۵٪) یا نوع ۲A (۳۶-۳۸٪) طبقه‌بندی شدند، اگرچه تعداد قابل توجهی از فیبرهای مخلوط نوع ۲A/۲X نیز شناسایی شدند (۱۶-۱۹٪). تفاوت قابل توجه این است که فیبرهای نوع خالص ۲X فقط در سطح RNA قابل شناسایی بودند، اما در سطح پروتئین قابل شناسایی نبودند، که نشان می‌دهد بیان سریع MYH حداقل تا حدی پس از رونویسی تنظیم می‌شود.
ما روش تعیین نوع فیبر MYH مبتنی بر پروتئومیکس خود را با استفاده از دات بلاتینگ مبتنی بر آنتی‌بادی اعتبارسنجی کردیم و هر دو روش در شناسایی فیبرهای خالص نوع 1 و نوع 2A به توافق 100٪ دست یافتند (شکل تکمیلی 2B را ببینید). با این حال، رویکرد مبتنی بر پروتئومیکس در شناسایی فیبرهای مختلط و تعیین کمیت نسبت هر ژن MYH در هر فیبر حساس‌تر و کارآمدتر بود. این داده‌ها اثربخشی استفاده از یک رویکرد عینی و بسیار حساس مبتنی بر اومیکس را برای توصیف انواع فیبرهای عضله اسکلتی نشان می‌دهند.
سپس از اطلاعات ترکیبی ارائه شده توسط ترانسکریپتومیکس و پروتئومیکس برای طبقه‌بندی عینی میوفیبرها بر اساس ترانسکریپتوم یا پروتئوم کامل آنها استفاده کردیم. با استفاده از روش تقریب و تصویرسازی منیفولد یکنواخت (UMAP) برای کاهش ابعاد به شش مؤلفه اصلی (شکل‌های تکمیلی 3A-B)، توانستیم تنوع میوفیبرها را در ترانسکریپتوم (شکل 1G) و پروتئوم (شکل 1H) تجسم کنیم. نکته قابل توجه این است که میوفیبرها نه در مجموعه داده‌های ترانسکریپتومیکس و نه در مجموعه داده‌های پروتئومیکس، بر اساس شرکت‌کنندگان (شکل‌های تکمیلی 3C-D) یا روزهای آزمایش (شکل تکمیلی 3E) گروه‌بندی نشده بودند، که نشان می‌دهد تنوع درون فردی در فیبرهای عضله اسکلتی بیشتر از تنوع بین فردی است. در نمودار UMAP، دو خوشه مجزا که نشان‌دهنده میوفیبرهای "سریع" و "کند" هستند، پدیدار شدند (شکل‌های 1G-H). میوفیبرهای MYH7+ (کند) در قطب مثبت UMAP1 خوشه‌بندی شدند، در حالی که میوفیبرهای MYH2+ و MYH1+ (سریع) در قطب منفی UMAP1 خوشه‌بندی شدند (شکل‌های 1I-J). با این حال، هیچ تمایزی بین انواع فیبرهای تندانقباض (یعنی نوع 2A، نوع 2X یا مخلوط 2A/2X) بر اساس بیان MYH صورت نگرفت، که نشان می‌دهد بیان MYH1 (شکل 1I-J) یا سایر نشانگرهای کلاسیک میوفیبر 2X مانند ACTN3 یا MYLK2 (شکل‌های تکمیلی 4A-B) هنگام بررسی کل ترانسکریپتوم یا پروتئوم، بین انواع مختلف میوفیبر تمایز قائل نمی‌شود. علاوه بر این، در مقایسه با MYH2 و MYH7، تعداد کمی از رونوشت‌ها یا پروتئین‌ها با MYH1 همبستگی مثبت داشتند (شکل‌های تکمیلی 4C-H)، که نشان می‌دهد فراوانی MYH1 به طور کامل منعکس کننده ترانسکریپتوم/پروتئوم میوفیبر نیست. نتایج مشابهی هنگام ارزیابی بیان مختلط سه ایزوفرم MYH در سطح UMAP به دست آمد (شکل‌های تکمیلی 4I-J). بنابراین، در حالی که می‌توان فیبرهای 2X را در سطح رونوشت تنها بر اساس کمی‌سازی MYH شناسایی کرد، فیبرهای MYH1+ هنگام بررسی کل رونوشت یا پروتئوم از سایر فیبرهای سریع قابل تشخیص نیستند.
به عنوان یک بررسی اولیه از ناهمگونی فیبر آهسته فراتر از MYH، ما چهار پروتئین خاص نوع فیبر آهسته را ارزیابی کردیم: TPM3، TNNT1، MYL3 و ATP2A22. زیرگروه‌های فیبر آهسته همبستگی پیرسون بالا، اگرچه نه کامل، با MYH7 را در هر دو ترانسکریپتومیکس (شکل تکمیلی 5A) و پروتئومیکس (شکل تکمیلی 5B) نشان دادند. تقریباً 25٪ و 33٪ از فیبرهای آهسته به ترتیب توسط همه زیرگروه‌های ژن/پروتئین در ترانسکریپتومیکس (شکل تکمیلی 5C) و پروتئومیکس (شکل تکمیلی 5D) به عنوان فیبرهای آهسته خالص طبقه‌بندی نشدند. بنابراین، طبقه‌بندی فیبر آهسته بر اساس چندین زیرگروه ژن/پروتئین، حتی برای پروتئین‌هایی که به عنوان خاص نوع فیبر شناخته می‌شوند، پیچیدگی بیشتری ایجاد می‌کند. این نشان می‌دهد که طبقه‌بندی فیبر بر اساس ایزوفرم‌های یک خانواده ژن/پروتئین واحد ممکن است به طور کافی ناهمگونی واقعی فیبرهای عضله اسکلتی را منعکس نکند.
برای بررسی بیشتر تنوع فنوتیپی فیبرهای عضله اسکلتی انسان در مقیاس کل مدل اومیکس، ما کاهش ابعاد بی‌طرفانه داده‌ها را با استفاده از تحلیل مؤلفه‌های اصلی (PCA) انجام دادیم (شکل 2A). مشابه نمودارهای UMAP، نه شرکت‌کننده و نه روز آزمایش بر خوشه‌بندی فیبر در سطح PCA تأثیری نداشتند (شکل‌های تکمیلی 6A-C). در هر دو مجموعه داده‌ها، نوع فیبر مبتنی بر MYH توسط PC2 توضیح داده شد، که یک خوشه از فیبرهای کند انقباض نوع 1 و یک خوشه دوم حاوی فیبرهای تند انقباض نوع 2A، نوع 2X و مخلوط 2A/2X را نشان می‌داد (شکل 2A). در هر دو مجموعه داده‌ها، این دو خوشه توسط تعداد کمی از فیبرهای مخلوط نوع 1/2A به هم متصل شده بودند. همانطور که انتظار می‌رفت، تجزیه و تحلیل بیش از حد محرک‌های اصلی PC تأیید کرد که PC2 توسط امضاهای انقباضی و متابولیکی هدایت می‌شود (شکل 2B و شکل‌های تکمیلی 6D-E، مجموعه داده‌های تکمیلی 5-6). به طور کلی، نوع فیبر مبتنی بر MYH برای توضیح تنوع مداوم در امتداد PC2 کافی بود، به استثنای فیبرهای به اصطلاح 2X که در سراسر ترانسکریپتوم در خوشه سریع توزیع شده بودند.
الف. نمودارهای تحلیل مؤلفه اصلی (PCA) از مجموعه داده‌های ترانسکریپتوم و پروتئوم که بر اساس نوع فیبر بر اساس MYH رنگ‌آمیزی شده‌اند. ب. تحلیل غنی‌سازی محرک‌های رونوشت و پروتئین در PC2 و PC1. تحلیل آماری با استفاده از بسته clusterProfiler و مقادیر p تنظیم‌شده Benjamini-Hochberg انجام شد. ج، د. نمودارهای PCA که بر اساس اصطلاحات هستی‌شناسی ژن چسبندگی بین سلولی (GO) در ترانسکریپتوم و اصطلاحات GO کاستامر در پروتئوم رنگ‌آمیزی شده‌اند. فلش‌ها نشان‌دهنده محرک‌های رونوشت و پروتئین و جهت آنها هستند. ه، ف. نمودارهای تقریب و تصویرسازی منیفولد یکنواخت (UMAP) از ویژگی‌های بالینی مرتبط که شیب‌های بیان را مستقل از نوع فیبر کند/سریع نشان می‌دهند. گ، ح. همبستگی بین محرک‌های PC2 و PC1 در ترانسکریپتوم‌ها و پروتئوم‌ها.
به طور غیرمنتظره‌ای، نوع میوفیبر مبتنی بر MYH تنها دومین درجه بالای تغییرپذیری (PC2) را توضیح داد، که نشان می‌دهد سایر عوامل بیولوژیکی غیرمرتبط با نوع میوفیبر مبتنی بر MYH (PC1) نقش مهمی در تنظیم ناهمگونی فیبر عضله اسکلتی دارند. تجزیه و تحلیل بیش از حد از محرک‌های اصلی در PC1 نشان داد که تغییرپذیری در PC1 در درجه اول توسط چسبندگی سلول-سلول و محتوای ریبوزوم در ترانسکریپتوم و کاستامرها و پروتئین‌های ریبوزومی در پروتئوم تعیین می‌شود (شکل 2B و شکل‌های تکمیلی 6D-E، مجموعه داده‌های تکمیلی 7). در عضله اسکلتی، کاستامرها دیسک Z را به سارکولما متصل می‌کنند و در انتقال نیرو و سیگنالینگ نقش دارند. 25 نمودار PCA حاشیه‌نویسی شده با استفاده از ویژگی‌های چسبندگی سلول-سلول (ترانسکریپتوم، شکل 2C) و کاستامر (پروتئوم، شکل 2D) یک تغییر قوی به چپ در PC1 را نشان داد، که نشان می‌دهد این ویژگی‌ها در فیبرهای خاصی غنی شده‌اند.
بررسی دقیق‌تر خوشه‌بندی میوفیبرها در سطح UMAP نشان داد که اکثر ویژگی‌ها، یک گرادیان بیان مبتنی بر MYH مستقل از نوع میوفیبر را نشان می‌دهند، نه یک گرادیان بیان مبتنی بر زیرخوشه میوفیبر. این پیوستگی برای چندین ژن مرتبط با شرایط پاتولوژیک مشاهده شد (شکل 2E)، مانند CHCHD10 (بیماری عصبی-عضلانی)، SLIT3 (آتروفی عضلانی)، CTDNEP1 (بیماری عضلانی). این پیوستگی همچنین در سراسر پروتئوم، از جمله پروتئین‌های مرتبط با اختلالات عصبی (UGDH)، سیگنالینگ انسولین (PHIP) و رونویسی (HIST1H2AB) مشاهده شد (شکل 2F). در مجموع، این داده‌ها نشان‌دهنده پیوستگی در ناهمگونی انقباض آهسته/تند مستقل از نوع فیبر در سراسر میوفیبرهای مختلف هستند.
جالب توجه است که ژن‌های محرک در PC2 همبستگی خوبی بین ترانسکریپتوم-پروتئوم نشان دادند (r = 0.663) (شکل 2G)، که نشان می‌دهد انواع فیبرهای کند و تند انقباض، و به ویژه خواص انقباضی و متابولیکی فیبرهای عضله اسکلتی، به صورت رونویسی تنظیم می‌شوند. با این حال، ژن‌های محرک در PC1 هیچ همبستگی ترانسکریپتوم-پروتئوم نشان ندادند (r = -0.027) (شکل 2H)، که نشان می‌دهد تغییرات غیرمرتبط با انواع فیبرهای کند/ تند انقباض تا حد زیادی پس از رونویسی تنظیم می‌شوند. از آنجا که تغییرات در PC1 در درجه اول توسط اصطلاحات هستی‌شناسی ژن ریبوزومی توضیح داده شده بود، و با توجه به اینکه ریبوزوم‌ها با مشارکت فعال در ترجمه پروتئین و تأثیرگذاری بر آن، نقش حیاتی و تخصصی در سلول ایفا می‌کنند،31 در مرحله بعد به بررسی این ناهمگونی غیرمنتظره ریبوزومی پرداختیم.
ما ابتدا نمودار تحلیل مؤلفه اصلی پروتئومیکس را بر اساس فراوانی نسبی پروتئین‌ها در اصطلاح GOCC "ریبوزوم سیتوپلاسمی" رنگ‌آمیزی کردیم (شکل 3A). اگرچه این اصطلاح در سمت مثبت PC1 غنی شده است و منجر به یک گرادیان کوچک می‌شود، پروتئین‌های ریبوزومی پارتیشن‌بندی را در هر دو جهت PC1 هدایت می‌کنند (شکل 3A). پروتئین‌های ریبوزومی غنی شده در سمت منفی PC1 شامل RPL18، RPS18 و RPS13 بودند (شکل 3B)، در حالی که RPL31، RPL35 و RPL38 (شکل 3C) محرک‌های اصلی در سمت مثبت PC1 بودند. جالب توجه است که RPL38 و RPS13 در مقایسه با سایر بافت‌ها در عضله اسکلتی بسیار بیان شدند (شکل تکمیلی 7A). این امضاهای ریبوزومی متمایز در PC1 در ترانسکریپتوم مشاهده نشدند (شکل تکمیلی 7B)، که نشان دهنده تنظیم پس از رونویسی است.
الف. نمودار تحلیل مؤلفه‌های اصلی (PCA) که بر اساس اصطلاحات هستی‌شناسی ژن ریبوزومی سیتوپلاسمی (GO) در سراسر پروتئوم رنگ‌آمیزی شده است. فلش‌ها جهت تغییرات واسطه‌شده توسط پروتئین را در نمودار PCA نشان می‌دهند. طول خط مربوط به امتیاز مؤلفه‌های اصلی برای یک پروتئین معین است. ب، ج. نمودارهای ویژگی PCA برای RPS13 و RPL38. د. تحلیل خوشه‌ای سلسله مراتبی بدون نظارت پروتئین‌های ریبوزومی سیتوپلاسمی. ه. مدل ساختاری ریبوزوم 80S (PDB: 4V6X) که پروتئین‌های ریبوزومی با فراوانی‌های مختلف در فیبرهای عضله اسکلتی را برجسته می‌کند. و. پروتئین‌های ریبوزومی با استوکیومتری مختلف که در نزدیکی کانال خروجی mRNA قرار گرفته‌اند.
مفاهیم ناهمگونی و تخصص ریبوزومی قبلاً مطرح شده‌اند، که در آن وجود زیرجمعیت‌های متمایز ریبوزوم (ناهمگونی ریبوزومی) می‌تواند مستقیماً بر ترجمه پروتئین در بافت‌های مختلف32 و سلول‌های33 از طریق ترجمه انتخابی مجموعه‌های رونوشت mRNA خاص34 (تخصص ریبوزوم) تأثیر بگذارد. برای شناسایی زیرجمعیت‌های پروتئین‌های ریبوزومی که همزمان در فیبرهای عضله اسکلتی بیان می‌شوند، ما یک تجزیه و تحلیل خوشه‌بندی سلسله مراتبی بدون نظارت از پروتئین‌های ریبوزومی در پروتئوم انجام دادیم (شکل 3D، مجموعه داده‌های تکمیلی 8). همانطور که انتظار می‌رفت، پروتئین‌های ریبوزومی بر اساس نوع فیبر بر اساس MYH خوشه‌بندی نشدند. با این حال، ما سه خوشه متمایز از پروتئین‌های ریبوزومی را شناسایی کردیم. خوشه اول (ribosomal_cluster_1) با RPL38 تنظیم می‌شود و از این رو بیان آن در فیبرهایی با پروفایل PC1 مثبت افزایش می‌یابد. خوشه دوم (ribosomal_cluster_2) با RPS13 تنظیم می‌شود و در فیبرهایی با پروفایل PC1 منفی افزایش می‌یابد. خوشه سوم (ribosomal_cluster_3) بیان افتراقی هماهنگی را در فیبرهای عضله اسکلتی نشان نمی‌دهد و می‌توان آن را پروتئین ریبوزومی "هسته" عضله اسکلتی در نظر گرفت. هر دو خوشه ریبوزومی 1 و 2 حاوی پروتئین‌های ریبوزومی هستند که قبلاً نشان داده شده است که ترجمه جایگزین را تنظیم می‌کنند (مثلاً RPL10A، RPL38، RPS19 و RPS25) و از نظر عملکردی بر توسعه تأثیر می‌گذارند (مثلاً RPL10A، RPL38).34،35،36،37،38 مطابق با نتایج PCA، نمایش ناهمگن مشاهده شده از این پروتئین‌های ریبوزومی در سراسر فیبرها نیز پیوستگی را نشان داد (شکل تکمیلی 7C).
برای تجسم محل پروتئین‌های ریبوزومی ناهمگن در داخل ریبوزوم، از یک مدل ساختاری ریبوزوم 80S انسانی (بانک داده‌های پروتئین: 4V6X) استفاده کردیم (شکل 3E). پس از جداسازی پروتئین‌های ریبوزومی متعلق به خوشه‌های ریبوزومی مختلف، محل قرارگیری آنها به طور دقیق هم‌تراز نبود، که نشان می‌دهد رویکرد ما نتوانسته است غنی‌سازی را برای مناطق/بخش‌های خاصی از ریبوزوم فراهم کند. با این حال، جالب توجه است که نسبت پروتئین‌های زیر واحد بزرگ در خوشه 2 کمتر از خوشه‌های 1 و 3 بود (شکل تکمیلی 7D). ما مشاهده کردیم که پروتئین‌هایی با استوکیومتری تغییر یافته در فیبرهای عضله اسکلتی عمدتاً در سطح ریبوزوم قرار دارند (شکل 3E)، که با توانایی آنها در تعامل با عناصر محل ورود ریبوزوم داخلی (IRES) در جمعیت‌های مختلف mRNA سازگار است و در نتیجه ترجمه انتخابی را هماهنگ می‌کند. 40، 41 علاوه بر این، بسیاری از پروتئین‌ها با استوکیومتری تغییر یافته در فیبرهای عضله اسکلتی در نزدیکی نواحی عملکردی مانند تونل خروجی mRNA (شکل 3F) قرار داشتند که به طور انتخابی طویل شدن ترجمه و توقف پپتیدهای خاص را تنظیم می‌کنند. 42 به طور خلاصه، داده‌های ما نشان می‌دهد که استوکیومتری پروتئین‌های ریبوزومی عضله اسکلتی ناهمگونی را نشان می‌دهد و منجر به تفاوت بین فیبرهای عضله اسکلتی می‌شود.
در ادامه، ما به شناسایی نشانه‌های فیبرهای تند و کند انقباض و بررسی مکانیسم‌های تنظیم رونویسی آنها پرداختیم. با مقایسه خوشه‌های فیبرهای تند و کند انقباض تعریف شده توسط UMAP در دو مجموعه داده (شکل‌های 1G-H و 4A-B)، تجزیه و تحلیل‌های ترانسکریپتومیک و پروتئومیک به ترتیب 1366 و 804 ویژگی با فراوانی متفاوت را شناسایی کردند (شکل‌های 4A-B، مجموعه داده‌های تکمیلی 9-12). ما تفاوت‌های مورد انتظار در نشانه‌های مربوط به سارکومرها (مثلاً تروپومیوزین و تروپونین)، جفت شدن تحریک-انقباض (ایزوفرم‌های SERCA) و متابولیسم انرژی (مثلاً ALDOA و CKB) را مشاهده کردیم. علاوه بر این، رونوشت‌ها و پروتئین‌های تنظیم‌کننده یوبیکوئیتیناسیون پروتئین به طور متفاوتی در فیبرهای تند و کند انقباض بیان شدند (مثلاً USP54، SH3RF2، USP28 و USP48) (شکل‌های 4A-B). علاوه بر این، ژن پروتئین میکروبی RP11-451G4.2 (DWORF)، که قبلاً نشان داده شده است که به طور متفاوتی در انواع فیبرهای عضلانی بره بیان می‌شود43 و فعالیت SERCA را در عضله قلبی افزایش می‌دهد44، به طور قابل توجهی در فیبرهای عضلانی اسکلتی کند افزایش یافته است (شکل 4A). به طور مشابه، در سطح فیبرهای منفرد، تفاوت‌های قابل توجهی در امضاهای شناخته شده مانند ایزوفرم‌های لاکتات دهیدروژناز مرتبط با متابولیسم (LDHA و LDHB، شکل 4C و شکل تکمیلی 8A)45،46 و همچنین امضاهای خاص نوع فیبر که قبلاً ناشناخته بودند (مانند IRX3، USP54، USP28 و DPYSL3) مشاهده شد (شکل 4C). همپوشانی قابل توجهی از ویژگی‌های بیان شده متفاوت بین مجموعه داده‌های رونویسی و پروتئوم وجود داشت (شکل تکمیلی 8B)، و همچنین همبستگی تغییر فولد که عمدتاً توسط بیان متفاوت‌تر ویژگی‌های سارکومر هدایت می‌شود (شکل تکمیلی 8C). نکته قابل توجه این است که برخی از امضاها (مثلاً USP28، USP48، GOLGA4، AKAP13) فقط در سطح پروتئومیک، تنظیم پس از رونویسی قوی نشان دادند و پروفایل‌های بیان مختص نوع فیبر کند/تند انقباض داشتند (شکل تکمیلی 8C).
نمودارهای آتشفشانی A و B که خوشه‌های کند و سریع را که توسط نمودارهای تقریب و پیش‌بینی منیفولد یکنواخت (UMAP) در شکل‌های 1G-H شناسایی شده‌اند، مقایسه می‌کنند. نقاط رنگی نشان دهنده رونوشت‌ها یا پروتئین‌هایی هستند که در FDR < 0.05 تفاوت معنی‌داری دارند و نقاط تیره‌تر نشان دهنده رونوشت‌ها یا پروتئین‌هایی هستند که در تغییر لگاریتمی > 1 تفاوت معنی‌داری دارند. تجزیه و تحلیل آماری دو طرفه با استفاده از آزمون DESeq2 Wald با مقادیر p تنظیم شده Benjamini-Hochberg (ترانسکریپتومیکس) یا روش مدل خطی Limma با تجزیه و تحلیل بیزی تجربی و به دنبال آن تنظیم Benjamini-Hochberg برای مقایسه‌های چندگانه (پروتئومیکس) انجام شد. C نمودارهای امضا از ژن‌ها یا پروتئین‌های انتخاب شده با بیان متفاوت بین فیبرهای کند و سریع. D تجزیه و تحلیل غنی‌سازی رونوشت‌ها و پروتئین‌های با بیان متفاوت. مقادیر همپوشانی در هر دو مجموعه داده غنی شده‌اند، مقادیر رونوشت فقط در رونوشت غنی شده‌اند و مقادیر پروتئوم فقط در پروتئوم غنی شده‌اند. تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از بسته clusterProfiler با مقادیر p تعدیل‌شده Benjamini-Hochberg انجام شد. ه. فاکتورهای رونویسی خاص نوع فیبر که توسط SCENIC بر اساس نمرات اختصاصیت تنظیم‌کننده مشتق‌شده از SCENIC و بیان mRNA متفاوت بین انواع فیبر شناسایی شدند. و. پروفایل کردن فاکتورهای رونویسی انتخاب‌شده که به طور متفاوت بین فیبرهای کند و سریع بیان می‌شوند.
سپس ما یک تجزیه و تحلیل بیش از حد بازنمایی ژن‌ها و پروتئین‌های با نمایش متفاوت انجام دادیم (شکل 4D، مجموعه داده‌های تکمیلی 13). غنی‌سازی مسیر برای ویژگی‌هایی که بین دو مجموعه داده متفاوت بودند، تفاوت‌های مورد انتظار، مانند فرآیندهای بتا-اکسیداسیون اسید چرب و متابولیسم کتون (فیبرهای کند)، انقباض میوفیلامنت/عضله (به ترتیب فیبرهای سریع و کند) و فرآیندهای کاتابولیک کربوهیدرات (فیبرهای سریع) را نشان داد. فعالیت پروتئین فسفاتاز سرین/ترئونین نیز در فیبرهای سریع افزایش یافته بود، که ناشی از ویژگی‌هایی مانند زیر واحدهای فسفاتاز تنظیمی و کاتالیزوری (PPP3CB، PPP1R3D و PPP1R3A) بود که به عنوان تنظیم‌کننده متابولیسم گلیکوژن شناخته می‌شوند (47) (شکل‌های تکمیلی 8D-E). مسیرهای دیگری که در فیبرهای سریع غنی شده بودند شامل پردازش اجسام (P-) (YTHDF3، TRIM21، LSM2) در پروتئوم (شکل تکمیلی 8F)، که به طور بالقوه در تنظیم پس از رونویسی (48) نقش دارند، و فعالیت فاکتور رونویسی (SREBF1، RXRG، RORA) در ترانسکریپتوم (شکل تکمیلی 8G) بودند. فیبرهای آهسته در فعالیت اکسیدوردوکتاز (BDH1، DCXR، TXN2) (شکل تکمیلی 8H)، اتصال آمید (CPTP، PFDN2، CRYAB) (شکل تکمیلی 8I)، ماتریکس خارج سلولی (CTSD، ADAMTSL4، LAMC1) (شکل تکمیلی 8J) و فعالیت گیرنده-لیگاند (FNDC5، SPX، NENF) (شکل تکمیلی 8K) غنی شده بودند.
برای کسب بینش بیشتر در مورد تنظیم رونویسی زیربنایی ویژگی‌های نوع فیبر عضلانی کند/سریع، ما تجزیه و تحلیل غنی‌سازی فاکتور رونویسی را با استفاده از SCENIC49 (مجموعه داده‌های تکمیلی 14) انجام دادیم. بسیاری از فاکتورهای رونویسی به طور قابل توجهی بین فیبرهای عضلانی سریع و کند غنی شدند (شکل 4E). این شامل فاکتورهای رونویسی مانند MAFA، که قبلاً با توسعه فیبر عضلانی سریع مرتبط دانسته شده است،50 و همچنین چندین فاکتور رونویسی که قبلاً با برنامه‌های ژنی خاص نوع فیبر عضلانی مرتبط نبودند، می‌شد. در میان اینها، PITX1، EGR1 و MYF6 غنی‌ترین فاکتورهای رونویسی در فیبرهای عضلانی سریع بودند (شکل 4E). در مقابل، ZSCAN30 و EPAS1 (که با نام HIF2A نیز شناخته می‌شود) غنی‌ترین فاکتورهای رونویسی در فیبرهای عضلانی کند بودند (شکل 4E). مطابق با این، MAFA در ناحیه UMAP مربوط به فیبرهای عضلانی سریع در سطوح بالاتری بیان شد، در حالی که EPAS1 الگوی بیان معکوسی داشت (شکل 4F).
علاوه بر ژن‌های شناخته‌شده‌ی کدکننده‌ی پروتئین، بیوتیپ‌های RNA غیرکدکننده‌ی متعددی وجود دارند که ممکن است در تنظیم رشد و بیماری‌های انسان نقش داشته باشند. 51، 52 در مجموعه داده‌های ترانسکریپتوم، چندین RNA غیرکدکننده، ویژگی نوع فیبر را نشان می‌دهند (شکل 5A و مجموعه داده‌های تکمیلی 15)، از جمله LINC01405، که برای فیبرهای کند بسیار اختصاصی است و گزارش شده است که در عضله‌ی بیماران مبتلا به میوپاتی میتوکندری کاهش یافته است. 53 در مقابل، RP11-255P5.3، مربوط به ژن lnc-ERCC5-5 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54، ویژگی نوع فیبر سریع را نشان می‌دهد. هر دو ژن LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) و RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) ویژگی عضلات اسکلتی را نشان می‌دهند (شکل‌های تکمیلی 9A-B) و هیچ ژن انقباضی شناخته‌شده‌ای در همسایگی ژنومی 1 مگابایتی خود ندارند، که نشان می‌دهد آنها نقش تخصصی در تنظیم انواع فیبرها دارند تا تنظیم ژن‌های انقباضی مجاور. پروفایل‌های بیان اختصاصی نوع فیبر کند/سریع LINC01405 و RP11-255P5.3 به ترتیب با استفاده از RNAscope تأیید شدند (شکل‌های 5B-C).
الف. رونوشت‌های RNA غیر کدکننده به طور قابل توجهی در فیبرهای عضلانی کند و تند انقباض تنظیم می‌شوند. ب. تصاویر RNAscope نماینده که به ترتیب ویژگی نوع فیبر کند و تند انقباض LINC01405 و RP11-255P5.3 را نشان می‌دهند. نوار مقیاس = 50 میکرومتر. ج. کمی‌سازی بیان RNA غیر کدکننده خاص نوع میوفیبر که توسط RNAscope تعیین شده است (n = 3 بیوپسی از افراد مستقل، مقایسه فیبرهای عضلانی تند و کند در هر فرد). تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از آزمون t-student دو طرفه انجام شد. نمودارهای جعبه‌ای میانه و چارک‌های اول و سوم را نشان می‌دهند، و سبیل‌ها به مقادیر حداقل و حداکثر اشاره می‌کنند. د. گردش کار شناسایی پروتئین میکروبی De novo (ایجاد شده با BioRender.com). ه. پروتئین میکروبی LINC01405_ORF408:17441:17358 به طور خاص در فیبرهای عضلانی اسکلتی کند بیان می‌شود (n=5 بیوپسی از شرکت‌کنندگان مستقل، که فیبرهای عضلانی سریع و کند را در هر شرکت‌کننده مقایسه می‌کند). تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از روش مدل خطی Limm همراه با یک رویکرد بیزی تجربی انجام شد و به دنبال آن از روش Benjamini-Hochberg برای مقایسه‌های چندگانه با تنظیم p-value استفاده شد. نمودارهای جعبه‌ای، میانه، چارک اول و سوم را نشان می‌دهند، به طوری که سبیل‌ها به مقادیر حداکثر/حداقل اشاره می‌کنند.
اخیراً، مطالعات نشان داده‌اند که بسیاری از رونوشت‌های غیرکدکننده‌ی فرضی، پروتئین‌های میکروبی رونویسی‌شده را کدگذاری می‌کنند که برخی از آنها عملکرد عضلات را تنظیم می‌کنند. 44، 55 برای شناسایی پروتئین‌های میکروبی با ویژگی بالقوه‌ی نوع فیبر، ما مجموعه‌ی داده‌های پروتئوم 1000 فیبر خود را با استفاده از یک فایل FASTA سفارشی حاوی توالی رونوشت‌های غیرکدکننده (n = 305) موجود در مجموعه‌ی داده‌های رونوشت 1000 فیبر جستجو کردیم (شکل 5D). ما 197 پروتئین میکروبی را از 22 رونوشت مختلف شناسایی کردیم که 71 مورد از آنها به طور متفاوتی بین فیبرهای عضلانی اسکلتی کند و سریع تنظیم شده بودند (شکل تکمیلی 9C و مجموعه داده‌های تکمیلی 16). برای LINC01405، سه محصول پروتئین میکروبی شناسایی شد که یکی از آنها ویژگی فیبر کند مشابه رونوشت خود را نشان داد (شکل 5E و شکل تکمیلی 9D). بنابراین، ما LINC01405 را به عنوان ژنی که یک پروتئین میکروبی خاص برای فیبرهای عضلانی اسکلتی کند را کدگذاری می‌کند، شناسایی کردیم.
ما یک گردش کار جامع برای توصیف پروتئومیک در مقیاس بزرگ از فیبرهای عضلانی منفرد ایجاد کردیم و تنظیم‌کننده‌های ناهمگونی فیبر را در حالت‌های سالم شناسایی کردیم. ما این گردش کار را برای درک چگونگی تأثیر میوپاتی‌های نمالین بر ناهمگونی فیبر عضله اسکلتی به کار بردیم. میوپاتی‌های نمالین بیماری‌های عضلانی ارثی هستند که باعث ضعف عضلانی می‌شوند و در کودکان مبتلا، با طیف وسیعی از عوارض از جمله دیسترس تنفسی، اسکولیوز و محدودیت تحرک اندام بروز می‌کنند. 19،20 به طور معمول، در میوپاتی‌های نمالین، انواع بیماری‌زا در ژن‌هایی مانند اکتین آلفا 1 (ACTA1) منجر به غلبه ترکیب میوفیبر فیبر کند انقباض می‌شوند، اگرچه این اثر ناهمگن است. یک استثنای قابل توجه، میوپاتی نمالین تروپونین T1 (TNNT1) است که غلبه فیبرهای سریع دارد. بنابراین، درک بهتر ناهمگونی زیربنایی اختلال تنظیم فیبر عضله اسکلتی مشاهده شده در میوپاتی‌های نمالین ممکن است به حل رابطه پیچیده بین این بیماری‌ها و نوع میوفیبر کمک کند.
در مقایسه با گروه کنترل سالم (n=3 در هر گروه)، میوفیبرهای جدا شده از بیماران مبتلا به میوپاتی نمالین با جهش در ژن‌های ACTA1 و TNNT1، آتروفی یا دیستروفی میوفیبر قابل توجهی را نشان دادند (شکل 6A، جدول تکمیلی 3). این امر به دلیل محدود بودن مواد موجود، چالش‌های فنی قابل توجهی را برای تجزیه و تحلیل پروتئومیک ایجاد کرد. با وجود این، ما توانستیم 2485 پروتئین را در 272 میوفیبر اسکلتی شناسایی کنیم. پس از فیلتر کردن حداقل 1000 پروتئین کمّی شده در هر فیبر، 250 فیبر تحت تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک بعدی قرار گرفتند. پس از فیلتر کردن، به طور متوسط ​​1573 ± 359 پروتئین در هر فیبر کمّی شدند (شکل تکمیلی 10A، مجموعه داده‌های تکمیلی 17-18). نکته قابل توجه این است که با وجود کاهش قابل توجه در اندازه فیبر، عمق پروتئوم نمونه‌های بیماران میوپاتی نمالین تنها به میزان کمی کاهش یافت. علاوه بر این، پردازش این داده‌ها با استفاده از فایل‌های FASTA خودمان (شامل رونوشت‌های غیر کدکننده) به ما اجازه داد تا پنج پروتئین میکروبی را در میوفیبرهای اسکلتی بیماران مبتلا به میوپاتی نمالین شناسایی کنیم (مجموعه داده‌های تکمیلی 19). محدوده دینامیکی پروتئوم به طور قابل توجهی وسیع‌تر بود و کل پروتئین‌ها در گروه کنترل با نتایج تجزیه و تحلیل پروتئوم 1000 فیبری قبلی همبستگی خوبی داشتند (شکل تکمیلی 10B-C).
الف. تصاویر میکروسکوپی که آتروفی یا دیستروفی فیبر و غلبه انواع مختلف فیبر را بر اساس MYH در میوپاتی‌های نمالین ACTA1 و TNNT1 (NM) نشان می‌دهند. نوار مقیاس = 100 میکرومتر. برای اطمینان از تکرارپذیری رنگ‌آمیزی در بیماران ACTA1 و TNNT1، سه بیوپسی بیمار دو تا سه بار (چهار بخش در هر مورد) قبل از انتخاب تصاویر نماینده رنگ‌آمیزی شدند. ب. نسبت نوع فیبر در شرکت‌کنندگان بر اساس MYH. ج. نمودار تحلیل مؤلفه اصلی (PCA) فیبرهای عضله اسکلتی در بیماران مبتلا به میوپاتی‌های نمالین و گروه کنترل. د. فیبرهای عضله اسکلتی از بیماران مبتلا به میوپاتی‌های نمالین و گروه کنترل که بر روی نمودار PCA تعیین شده از 1000 فیبر تجزیه و تحلیل شده در شکل 2 تصویر شده‌اند. به عنوان مثال، نمودارهای آتشفشانی که تفاوت‌های بین شرکت‌کنندگان مبتلا به میوپاتی‌های نمالین ACTA1 و TNNT1 و گروه کنترل و بین شرکت‌کنندگان مبتلا به میوپاتی‌های نمالین ACTA1 و TNNT1 را مقایسه می‌کنند. دایره‌های رنگی نشان‌دهنده پروتئین‌هایی هستند که در π < 0.05 تفاوت معنی‌داری داشتند و نقاط تیره نشان‌دهنده پروتئین‌هایی هستند که در FDR < 0.05 تفاوت معنی‌داری داشتند. تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از روش مدل خطی لیما و روش‌های تجربی بیزی انجام شد و پس از آن تنظیم مقدار p برای مقایسه‌های چندگانه با استفاده از روش بنجامینی-هاچبرگ انجام شد. ح. تجزیه و تحلیل غنی‌سازی پروتئین‌های با بیان متفاوت در کل پروتئوم و در فیبرهای نوع 1 و 2A. تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از بسته clusterProfiler و مقادیر p تنظیم‌شده بنجامینی-هاچبرگ انجام شد. I, J. نمودارهای تجزیه و تحلیل مؤلفه اصلی (PCA) که با اصطلاحات ماتریکس خارج سلولی و هستی‌شناسی ژن میتوکندریایی (GO) رنگ‌آمیزی شده‌اند.
از آنجا که میوپاتی‌های نمالین می‌توانند بر نسبت انواع میوفیبر بیان‌کننده MYH در عضله اسکلتی تأثیر بگذارند،19،20 ابتدا انواع میوفیبر بیان‌کننده MYH را در بیماران مبتلا به میوپاتی‌های نمالین و گروه کنترل بررسی کردیم. ما نوع میوفیبر را با استفاده از یک روش بی‌طرفانه که قبلاً برای سنجش 1000 میوفیبر شرح داده شده بود (شکل‌های تکمیلی 10D-E) تعیین کردیم و دوباره نتوانستیم میوفیبرهای خالص 2X را شناسایی کنیم (شکل 6B). ما اثر ناهمگن میوپاتی‌های نمالین را بر نوع میوفیبر مشاهده کردیم، زیرا دو بیمار مبتلا به جهش‌های ACTA1 نسبت افزایش‌یافته‌ای از میوفیبرهای نوع 1 داشتند، در حالی که دو بیمار مبتلا به میوپاتی نمالین TNNT1 نسبت کاهش‌یافته‌ای از میوفیبرهای نوع 1 داشتند (شکل 6B). در واقع، بیان MYH2 و ایزوفرم‌های تروپونین سریع (TNNC2، TNNI2 و TNNT3) در میوپاتی‌های ACTA1-نمالین کاهش یافت، در حالی که بیان MYH7 در میوپاتی‌های TNNT1-نمالین کاهش یافت (شکل تکمیلی 11A). این با گزارش‌های قبلی از تغییر ناهمگن نوع میوفیبر در میوپاتی‌های نمالین سازگار است.19،20 ما این نتایج را با ایمونوهیستوشیمی تأیید کردیم و دریافتیم که بیماران مبتلا به میوپاتی ACTA1-نمالین، میوفیبرهای نوع 1 را غالب داشتند، در حالی که بیماران مبتلا به میوپاتی TNNT1-نمالین الگوی معکوسی داشتند (شکل 6A).
در سطح پروتئوم تک فیبری، فیبرهای عضله اسکلتی از بیماران ACTA1 و TNNT1 nemaline myopathy با اکثر فیبرهای گروه کنترل خوشه‌بندی شدند، و فیبرهای TNNT1 nemaline myopathy عموماً شدیدترین آسیب را داشتند (شکل 6C). این امر به ویژه هنگام رسم نمودارهای تحلیل مؤلفه اصلی (PCA) از فیبرهای شبه متورم برای هر بیمار مشهود بود، به طوری که بیماران TNNT1 nemaline myopathy 2 و 3 بیشترین فاصله را از نمونه‌های کنترل داشتند (شکل تکمیلی 11B، مجموعه داده‌های تکمیلی 20). برای درک بهتر چگونگی مقایسه فیبرهای بیماران میوپاتی با فیبرهای سالم، از اطلاعات دقیق به دست آمده از تحلیل پروتئومیک 1000 فیبر از شرکت‌کنندگان بزرگسال سالم استفاده کردیم. ما فیبرهای مجموعه داده‌های میوپاتی (بیماران ACTA1 و TNNT1 nemaline myopathy و گروه کنترل) را بر روی نمودار PCA به دست آمده از تحلیل پروتئومیک 1000 فیبری تصویر کردیم (شکل 6D). توزیع انواع فیبرهای MYH در امتداد PC2 در فیبرهای کنترل مشابه توزیع فیبر به‌دست‌آمده از آنالیز پروتئومیک ۱۰۰۰ فیبر بود. با این حال، اکثر فیبرها در بیماران میوپاتی نمالین به سمت PC2 تغییر مکان دادند و با فیبرهای تند انقباض سالم همپوشانی داشتند، صرف نظر از نوع فیبر MYH طبیعی آنها. بنابراین، اگرچه بیماران مبتلا به میوپاتی نمالین ACTA1 هنگام اندازه‌گیری کمی با استفاده از روش‌های مبتنی بر MYH، تغییر به سمت فیبرهای نوع ۱ را نشان دادند، اما هم میوپاتی نمالین ACTA1 و هم میوپاتی نمالین TNNT1 پروتئوم فیبر عضله اسکلتی را به سمت فیبرهای تند انقباض تغییر مکان دادند.
سپس ما هر گروه بیمار را مستقیماً با گروه کنترل سالم مقایسه کردیم و به ترتیب 256 و 552 پروتئین با بیان متفاوت را در میوپاتی‌های نمالین ACTA1 و TNNT1 شناسایی کردیم (شکل 6E-G و شکل تکمیلی 11C، مجموعه داده‌های تکمیلی 21). تجزیه و تحلیل غنی‌سازی ژن، کاهش هماهنگ پروتئین‌های میتوکندری را نشان داد (شکل 6H-I، مجموعه داده‌های تکمیلی 22). با کمال تعجب، با وجود غلبه متفاوت انواع فیبر در میوپاتی‌های نمالین ACTA1 و TNNT1، این کاهش کاملاً مستقل از نوع فیبر مبتنی بر MYH بود (شکل 6H و شکل‌های تکمیلی 11D-I، مجموعه داده‌های تکمیلی 23). سه پروتئین میکروبی نیز در میوپاتی‌های نمالین ACTA1 یا TNNT1 تنظیم شدند. دو مورد از این میکروپروتئین‌ها، ENSG00000215483_TR14_ORF67 (همچنین با نام‌های LINC00598 یا Lnc-FOXO1 شناخته می‌شوند) و ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2)، فراوانی متفاوتی را فقط در میوفیبرهای نوع 1 نشان دادند. قبلاً گزارش شده است که ENSG00000215483_TR14_ORF67 در تنظیم چرخه سلولی نقش دارد.56 از سوی دیگر، ENSG00000232046_TR1_ORF437 (مربوط به LINC01798) در میوفیبرهای نوع 1 و نوع 2A در میوپاتی ACTA1-نمالین در مقایسه با گروه کنترل سالم افزایش یافته است (شکل تکمیلی 12A، مجموعه داده‌های تکمیلی 24). در مقابل، پروتئین‌های ریبوزومی تا حد زیادی تحت تأثیر میوپاتی نمالین قرار نگرفتند، اگرچه RPS17 در میوپاتی نمالین ACTA1 کاهش یافت (شکل 6E).
تجزیه و تحلیل غنی‌سازی همچنین افزایش تنظیم فرآیندهای سیستم ایمنی را در میوپاتی‌های نمالین ACTA1 و TNNT1 نشان داد، در حالی که چسبندگی سلولی نیز در میوپاتی نمالین TNNT1 افزایش یافته بود (شکل 6H). غنی‌سازی این عوامل خارج سلولی توسط پروتئین‌های ماتریکس خارج سلولی که PCA را در PC1 و PC2 در جهت منفی (یعنی به سمت فیبرهای آسیب‌دیده‌تر) تغییر می‌دادند، منعکس شد (شکل 6J). هر دو گروه بیمار افزایش بیان پروتئین‌های خارج سلولی دخیل در پاسخ‌های ایمنی و مکانیسم‌های ترمیم سارکولما، مانند آنکسین‌ها (ANXA1، ANXA2، ANXA5)57،58 و پروتئین متقابل آنها S100A1159 را نشان دادند (شکل‌های تکمیلی 12B-C). قبلاً گزارش شده بود که این فرآیند در دیستروفی‌های عضلانی60 افزایش می‌یابد، اما تا آنجا که ما می‌دانیم، قبلاً با میوپاتی‌های نمالین مرتبط نبوده است. عملکرد طبیعی این دستگاه مولکولی برای ترمیم سارکولما پس از آسیب و برای ادغام میوسیت‌های تازه تشکیل شده با میوفیبرها ضروری است58،61. بنابراین، افزایش فعالیت این فرآیند در هر دو گروه بیمار نشان دهنده یک پاسخ ترمیمی به آسیب ناشی از بی‌ثباتی میوفیبر است.
اثرات هر یک از میوپاتی‌های نمالین به خوبی با هم مرتبط بودند (r = 0.736) و همپوشانی معقولی را نشان دادند (شکل‌های تکمیلی 11A-B)، که نشان می‌دهد میوپاتی نمالین ACTA1 و TNNT1 اثرات مشابهی بر پروتئوم دارند. با این حال، برخی از پروتئین‌ها فقط در میوپاتی نمالین ACTA1 یا TNNT1 تنظیم شدند (شکل‌های تکمیلی 11A و C). پروتئین پروفیبروتیک MFAP4 یکی از پروتئین‌هایی بود که بیشترین افزایش بیان را در میوپاتی نمالین TNNT1 داشت، اما در میوپاتی نمالین ACTA1 بدون تغییر باقی ماند. SKIC8، جزئی از کمپلکس PAF1C که مسئول تنظیم رونویسی ژن HOX است، در میوپاتی نمالین TNNT1 کاهش بیان یافت، اما در میوپاتی نمالین ACTA1 تحت تأثیر قرار نگرفت (شکل تکمیلی 11A). مقایسه مستقیم میوپاتی نمالین ACTA1 و TNNT1، کاهش بیشتر پروتئین‌های میتوکندری و افزایش پروتئین‌های سیستم ایمنی را در میوپاتی نمالین TNNT1 نشان داد (شکل 6G-H و شکل‌های تکمیلی 11C و 11H-I). این داده‌ها با آتروفی/دیستروفی بیشتر مشاهده شده در میوپاتی نمالین TNNT1 در مقایسه با میوپاتی نمالین TNNT1 (شکل 6A) سازگار است، که نشان می‌دهد میوپاتی نمالین TNNT1 نوع شدیدتری از بیماری است.
برای ارزیابی اینکه آیا اثرات مشاهده شده میوپاتی نمالین در کل سطح عضله ادامه دارد یا خیر، ما یک آنالیز پروتئومیک توده‌ای از بیوپسی‌های عضلانی از همان گروه از بیماران میوپاتی نمالین TNNT1 انجام دادیم و آنها را با گروه کنترل (n=3 در هر گروه) مقایسه کردیم (شکل تکمیلی 13A، مجموعه داده‌های تکمیلی 25). همانطور که انتظار می‌رفت، گروه کنترل در تجزیه و تحلیل مؤلفه‌های اصلی ارتباط نزدیکی داشتند، در حالی که بیماران میوپاتی نمالین TNNT1 تنوع بین نمونه‌ای بالاتری را مشابه آنچه در تجزیه و تحلیل تک فیبر مشاهده شد، نشان دادند (شکل تکمیلی 13B). تجزیه و تحلیل توده‌ای، پروتئین‌های با بیان متفاوت (شکل تکمیلی 13C، مجموعه داده‌های تکمیلی 26) و فرآیندهای بیولوژیکی (شکل تکمیلی 13D، مجموعه داده‌های تکمیلی 27) را که با مقایسه فیبرهای منفرد برجسته شده بودند، بازتولید کرد، اما توانایی تمایز بین انواع مختلف فیبر را از دست داد و نتوانست اثرات بیماری ناهمگن را در بین فیبرها در نظر بگیرد.
روی هم رفته، این داده‌ها نشان می‌دهند که پروتئومیکس تک میوفیبر می‌تواند ویژگی‌های بیولوژیکی بالینی را که با روش‌های هدفمند مانند ایمونوبلاتینگ قابل تشخیص نیستند، روشن کند. علاوه بر این، این داده‌ها محدودیت‌های استفاده از تایپینگ فیبر اکتین (MYH) به تنهایی برای توصیف سازگاری فنوتیپی را برجسته می‌کنند. در واقع، اگرچه تغییر نوع فیبر بین میوپاتی‌های نمالین اکتین و تروپونین متفاوت است، هر دو میوپاتی نمالین تایپینگ فیبر MYH را از متابولیسم فیبر عضله اسکلتی به سمت یک پروتئوم عضله سریع‌تر و کمتر اکسیداتیو جدا می‌کنند.
ناهمگونی سلولی برای بافت‌ها جهت برآورده کردن نیازهای متنوعشان حیاتی است. در عضله اسکلتی، این اغلب به عنوان انواع فیبرهایی توصیف می‌شود که با درجات مختلف تولید نیرو و خستگی‌پذیری مشخص می‌شوند. با این حال، واضح است که این تنها بخش کوچکی از تنوع فیبر عضله اسکلتی را توضیح می‌دهد، که بسیار متغیرتر، پیچیده‌تر و چندوجهی‌تر از آن چیزی است که قبلاً تصور می‌شد. پیشرفت‌های تکنولوژیکی اکنون عوامل تنظیم‌کننده فیبرهای عضله اسکلتی را روشن کرده‌اند. در واقع، داده‌های ما نشان می‌دهد که فیبرهای نوع 2X ممکن است یک زیرگروه فیبر عضله اسکلتی مجزا نباشند. علاوه بر این، ما پروتئین‌های متابولیک، پروتئین‌های ریبوزومی و پروتئین‌های مرتبط با سلول را به عنوان عوامل اصلی تعیین‌کننده ناهمگونی فیبر عضله اسکلتی شناسایی کردیم. با اعمال گردش کار پروتئومیک خود بر روی نمونه‌های بیمار مبتلا به میوپاتی نماتد، ما همچنین نشان دادیم که تایپینگ فیبر مبتنی بر MYH به طور کامل ناهمگونی عضله اسکلتی را منعکس نمی‌کند، به خصوص هنگامی که سیستم مختل می‌شود. در واقع، صرف نظر از نوع فیبر مبتنی بر MYH، میوپاتی نماتد منجر به تغییر به سمت فیبرهای سریع‌تر و کمتر اکسیداتیو می‌شود.
فیبرهای عضلانی اسکلتی از قرن نوزدهم طبقه‌بندی شده‌اند. تجزیه و تحلیل‌های اخیر اومیکس به ما این امکان را داده است که شروع به درک پروفایل‌های بیان انواع مختلف فیبر MYH و پاسخ‌های آنها به محرک‌های مختلف کنیم. همانطور که در اینجا توضیح داده شده است، رویکردهای اومیکس همچنین از این مزیت برخوردارند که نسبت به روش‌های سنتی مبتنی بر آنتی‌بادی، حساسیت بیشتری برای تعیین کمیت نشانگرهای نوع فیبر دارند، بدون اینکه به تعیین کمیت یک (یا چند) نشانگر برای تعریف نوع فیبر عضلانی اسکلتی متکی باشند. ما از گردش‌های کاری مکمل رونویسی و پروتئومیکی استفاده کردیم و نتایج را برای بررسی تنظیم رونویسی و پس از رونویسی ناهمگونی فیبر در فیبرهای عضلانی اسکلتی انسان ادغام کردیم. این گردش کاری منجر به عدم شناسایی فیبرهای خالص از نوع 2X در سطح پروتئین در عضله پهن خارجی گروه مردان جوان سالم ما شد. این با مطالعات قبلی تک فیبر که فیبرهای خالص 2X کمتر از 1٪ را در عضله پهن خارجی سالم یافته بودند، سازگار است، اگرچه این موضوع باید در آینده در سایر عضلات نیز تأیید شود. اختلاف بین تشخیص فیبرهای تقریباً خالص 2X در سطح mRNA و فقط فیبرهای مخلوط 2A/2X در سطح پروتئین، گیج‌کننده است. بیان mRNA ایزوفرم MYH به صورت شبانه‌روزی نیست،67 که نشان می‌دهد بعید است سیگنال شروع MYH2 را در فیبرهای به ظاهر خالص 2X در سطح RNA "از دست داده باشیم". یک توضیح احتمالی، اگرچه کاملاً فرضی است، می‌تواند تفاوت در پایداری پروتئین و/یا mRNA بین ایزوفرم‌های MYH باشد. در واقع، هیچ فیبر سریعی برای هیچ ایزوفرم MYH 100٪ خالص نیست و مشخص نیست که آیا سطوح بیان mRNA MYH1 در محدوده 70 تا 90 درصد منجر به فراوانی برابر MYH1 و MYH2 در سطح پروتئین می‌شود یا خیر. با این حال، هنگام بررسی کل ترانسکریپتوم یا پروتئوم، تجزیه و تحلیل خوشه‌ای می‌تواند با اطمینان تنها دو خوشه مجزا را که نشان دهنده فیبرهای عضله اسکلتی کند و سریع هستند، صرف نظر از ترکیب دقیق MYH آنها، شناسایی کند. این با تجزیه و تحلیل‌هایی که از رویکردهای رونویسی تک هسته‌ای استفاده می‌کنند، سازگار است که معمولاً فقط دو خوشه میونوکلئار مجزا را شناسایی می‌کنند. 68، 69، 70 علاوه بر این، اگرچه مطالعات پروتئومیک قبلی فیبرهای نوع 2X را شناسایی کرده‌اند، اما این فیبرها به طور جداگانه از بقیه فیبرهای سریع خوشه‌بندی نمی‌شوند و تنها تعداد کمی از پروتئین‌های با فراوانی متفاوت را در مقایسه با سایر انواع فیبر بر اساس MYH نشان می‌دهند. 14 این نتایج نشان می‌دهد که ما باید به دیدگاه اوایل قرن بیستم در مورد طبقه‌بندی فیبرهای عضلانی برگردیم، که فیبرهای عضله اسکلتی انسان را نه به سه دسته مجزا بر اساس MYH، بلکه به دو خوشه بر اساس خواص متابولیکی و انقباضی آنها تقسیم می‌کرد. 63
مهم‌تر از آن، ناهمگونی میوفیبر باید در ابعاد چندگانه در نظر گرفته شود. مطالعات قبلی "omics" در این راستا اشاره کرده‌اند و نشان می‌دهند که فیبرهای عضله اسکلتی خوشه‌های گسسته تشکیل نمی‌دهند، بلکه در امتداد یک پیوستار قرار گرفته‌اند. 11، 13، 14، 64، 71 در اینجا، ما نشان می‌دهیم که علاوه بر تفاوت در خواص انقباضی و متابولیکی عضله اسکلتی، میوفیبرها را می‌توان با ویژگی‌های مربوط به تعاملات سلول-سلول و مکانیسم‌های ترجمه از هم متمایز کرد. در واقع، ما ناهمگونی ریبوزوم را در فیبرهای عضله اسکلتی یافتیم که به ناهمگونی مستقل از انواع فیبر کند و سریع کمک می‌کند. علت اصلی این ناهمگونی قابل توجه میوفیبر، مستقل از نوع فیبر کند و سریع، هنوز مشخص نیست، اما ممکن است به سازماندهی فضایی تخصصی در دسته‌های عضلانی که به طور بهینه به نیروها و بارهای خاص پاسخ می‌دهند،72 ارتباط تخصصی سلولی یا اختصاصی اندام با سایر انواع سلول در ریزمحیط عضله 73،74،75 یا تفاوت در فعالیت ریبوزوم در میوفیبرهای منفرد اشاره داشته باشد. در واقع، نشان داده شده است که هتروپلاسمی ریبوزومی، چه از طریق جایگزینی پارالوگ RPL3 و RPL3L و چه در سطح 2′O-متیلاسیون rRNA، با هیپرتروفی عضله اسکلتی مرتبط است76،77. کاربردهای چند اُمی و فضایی همراه با توصیف عملکردی میوفیبرهای منفرد، درک ما از زیست‌شناسی عضله را در سطح چند اُمی بیشتر پیش خواهد برد78.
با تجزیه و تحلیل پروتئوم‌های تک میوفیبر از بیماران مبتلا به میوپاتی‌های نمالین، ما همچنین سودمندی، اثربخشی و قابلیت کاربرد پروتئومیکس تک میوفیبر را برای روشن کردن پاتوفیزیولوژی بالینی عضله اسکلتی نشان دادیم. علاوه بر این، با مقایسه گردش کار خود با تجزیه و تحلیل پروتئومیکس جهانی، توانستیم نشان دهیم که پروتئومیکس تک میوفیبر همان عمق اطلاعات پروتئومیکس بافت جهانی را ارائه می‌دهد و این عمق را با در نظر گرفتن ناهمگونی بین فیبری و نوع میوفیبر گسترش می‌دهد. علاوه بر تفاوت‌های مورد انتظار (البته متغیر) در نسبت نوع فیبر مشاهده شده در میوپاتی‌های نمالین ACTA1 و TNNT1 در مقایسه با گروه کنترل سالم،19 ما همچنین بازسازی اکسیداتیو و خارج سلولی را مستقل از تغییر نوع فیبر با واسطه MYH مشاهده کردیم. فیبروز قبلاً در میوپاتی‌های نمالین TNNT1 گزارش شده است.19 با این حال، تجزیه و تحلیل ما بر اساس این یافته بنا شده است و همچنین افزایش سطح پروتئین‌های ترشح شده خارج سلولی مرتبط با استرس، مانند آنکسین‌ها، که در مکانیسم‌های ترمیم سارکولما نقش دارند، را در میوفیبرهای بیماران مبتلا به میوپاتی‌های نمالین ACTA1 و TNNT1 نشان می‌دهد.57،58،59 در نتیجه، افزایش سطح آنکسین در میوفیبرهای بیماران مبتلا به میوپاتی نمالین ممکن است نشان دهنده یک پاسخ سلولی برای ترمیم میوفیبرهای به شدت آتروفیک باشد.
اگرچه این مطالعه بزرگترین تحلیل اومیکس کل عضله تک فیبری انسان تا به امروز را نشان می‌دهد، اما بدون محدودیت نیست. ما فیبرهای عضله اسکلتی را از یک نمونه نسبتاً کوچک و همگن از شرکت‌کنندگان و یک عضله واحد (عضله پهن خارجی) جدا کردیم. بنابراین، غیرممکن است که وجود جمعیت‌های فیبری خاص را در انواع عضلات و در فیزیولوژی عضلات در سطوح مختلف رد کنیم. به عنوان مثال، نمی‌توانیم احتمال ظهور زیرمجموعه‌ای از فیبرهای فوق سریع (مثلاً فیبرهای خالص 2X) را در دوندگان سرعت و/یا ورزشکاران قدرتی بسیار آموزش دیده79 یا در دوره‌های عدم فعالیت عضلانی66،80 رد کنیم. علاوه بر این، حجم نمونه محدود شرکت‌کنندگان مانع از بررسی تفاوت‌های جنسیتی در ناهمگونی فیبر شد، زیرا نسبت‌های نوع فیبر بین مردان و زنان متفاوت است. علاوه بر این، ما نتوانستیم تجزیه و تحلیل‌های رونویسی و پروتئومیک را روی فیبرهای عضلانی یکسان یا نمونه‌هایی از همان شرکت‌کنندگان انجام دهیم. همانطور که ما و دیگران به بهینه‌سازی آنالیزهای تک سلولی و تک میوفیبر با استفاده از آنالیز اومیکس برای دستیابی به ورودی نمونه بسیار کم ادامه می‌دهیم (همانطور که در اینجا در آنالیز فیبرهای بیماران مبتلا به میوپاتی میتوکندری نشان داده شده است)، فرصت ترکیب رویکردهای چند اومیکس (و عملکردی) در فیبرهای عضلانی منفرد آشکار می‌شود.
به طور کلی، داده‌های ما محرک‌های رونویسی و پس از رونویسی ناهمگونی عضلات اسکلتی را شناسایی و توضیح می‌دهند. به طور خاص، ما داده‌هایی را ارائه می‌دهیم که یک اصل دیرپا در فیزیولوژی عضلات اسکلتی مرتبط با تعریف کلاسیک مبتنی بر MYH از انواع فیبر را به چالش می‌کشد. ما امیدواریم که این بحث را تجدید کنیم و در نهایت درک خود را از طبقه‌بندی و ناهمگونی فیبر عضلات اسکلتی مورد بازنگری قرار دهیم.
چهارده شرکت‌کننده سفیدپوست (۱۲ مرد و ۲ زن) داوطلبانه موافقت خود را برای شرکت در این مطالعه اعلام کردند. این مطالعه توسط کمیته اخلاق بیمارستان دانشگاه گنت (BC-10237) تأیید شد، با اعلامیه هلسینکی ۲۰۱۳ مطابقت داشت و در ClinicalTrials.gov (NCT05131555) ثبت شد. مشخصات عمومی شرکت‌کنندگان در جدول تکمیلی ۱ ارائه شده است. پس از اخذ رضایت آگاهانه شفاهی و کتبی، شرکت‌کنندگان قبل از ورود نهایی به مطالعه تحت معاینه پزشکی قرار گرفتند. شرکت‌کنندگان جوان (۲۲ تا ۴۲ سال)، سالم (بدون بیماری، بدون سابقه سیگار کشیدن) و از نظر جسمی نسبتاً فعال بودند. حداکثر جذب اکسیژن با استفاده از یک ارگومتر پله‌ای برای ارزیابی آمادگی جسمانی همانطور که قبلاً توضیح داده شد، تعیین شد. ۸۱
نمونه‌های بیوپسی عضله سه بار در حالت استراحت و در حالت ناشتا، با فاصله ۱۴ روز از هم، جمع‌آوری شدند. از آنجا که این نمونه‌ها به عنوان بخشی از یک مطالعه بزرگتر جمع‌آوری شدند، شرکت‌کنندگان ۴۰ دقیقه قبل از بیوپسی، دارونما (لاکتوز)، یک آنتاگونیست گیرنده H1 (540 میلی‌گرم فکسوفنادین) یا یک آنتاگونیست گیرنده H2 (40 میلی‌گرم فاموتیدین) مصرف کردند. ما قبلاً نشان داده‌ایم که این آنتاگونیست‌های گیرنده هیستامین بر آمادگی عضلات اسکلتی در حالت استراحت تأثیری ندارند81، و هیچ خوشه‌بندی مرتبط با وضعیت در نمودارهای کنترل کیفیت ما مشاهده نشد (شکل‌های تکمیلی ۳ و ۶). یک رژیم غذایی استاندارد (۴۱.۴ کیلوکالری بر کیلوگرم وزن بدن، ۵.۱ گرم بر کیلوگرم وزن بدن کربوهیدرات، ۱.۴ گرم بر کیلوگرم وزن بدن پروتئین و ۱.۶ گرم بر کیلوگرم وزن بدن چربی) به مدت ۴۸ ساعت قبل از هر روز آزمایش رعایت شد و یک صبحانه استاندارد (۱.۵ گرم بر کیلوگرم وزن بدن کربوهیدرات) در صبح روز آزمایش مصرف شد. تحت بی‌حسی موضعی (0.5 میلی‌لیتر لیدوکائین 1% بدون اپی‌نفرین)، بیوپسی‌های عضلانی از عضله پهن خارجی با استفاده از آسپیراسیون برگستروم از راه پوست گرفته شد.82 نمونه‌های عضلانی بلافاصله در RNAlater جاسازی شده و تا زمان تشریح دستی فیبر (تا 3 روز) در دمای 4 درجه سانتیگراد نگهداری شدند.
دسته‌های میوفیبر تازه جدا شده به محیط کشت RNAlater تازه در ظرف کشت منتقل شدند. سپس میوفیبرهای منفرد با استفاده از استریومیکروسکوپ و موچین‌های ظریف به صورت دستی تشریح شدند. بیست و پنج فیبر از هر بیوپسی تشریح شد و توجه ویژه‌ای به انتخاب فیبرها از نواحی مختلف بیوپسی شد. پس از تشریح، هر فیبر به آرامی در 3 میکرولیتر بافر لیز (SingleShot Cell Lysis Kit، Bio-Rad) حاوی آنزیم‌های پروتئیناز K و DNase برای حذف پروتئین‌ها و DNA ناخواسته غوطه‌ور شد. سپس لیز سلولی و حذف پروتئین/DNA با ورتکس کردن مختصر، چرخاندن مایع در میکروسانتریفیوژ و انکوباسیون در دمای اتاق (10 دقیقه) آغاز شد. سپس لیزات در یک دستگاه ترمال سایکلر (T100، Bio-Rad) در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه، 75 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه انکوبه شد و سپس بلافاصله تا زمان پردازش بیشتر در دمای -80 درجه سانتیگراد نگهداری شد.
کتابخانه‌های RNA پلی‌آدنیله سازگار با Illumina از 2 میکرولیتر لیزات میوفیبر با استفاده از کیت آماده‌سازی کتابخانه QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq (Lexogen) تهیه شدند. روش‌های دقیق را می‌توان در دفترچه راهنمای سازنده یافت. این فرآیند با سنتز cDNA رشته اول با رونویسی معکوس آغاز می‌شود که طی آن شناسه‌های مولکولی منحصر به فرد (UMI) و بارکدهای i1 مخصوص نمونه برای اطمینان از جمع‌آوری نمونه‌ها و کاهش تنوع فنی در طول پردازش‌های بعدی معرفی می‌شوند. سپس cDNA از 96 میوفیبر با مهره‌های مغناطیسی جمع‌آوری و خالص‌سازی می‌شود، پس از آن RNA حذف شده و سنتز رشته دوم با استفاده از آغازگرهای تصادفی انجام می‌شود. کتابخانه با مهره‌های مغناطیسی خالص‌سازی می‌شود، برچسب‌های i5/i7 مخصوص مخزن اضافه می‌شوند و PCR تکثیر می‌شود. مرحله نهایی خالص‌سازی، کتابخانه‌های سازگار با Illumina را تولید می‌کند. کیفیت هر مخزن کتابخانه با استفاده از کیت تجزیه و تحلیل DNA قطعات کوچک با حساسیت بالا (Agilent Technologies، DNF-477-0500) ارزیابی شد.
بر اساس کمی‌سازی کیوبیت، مجموعه‌ها در غلظت‌های معادل (2 نانومولار) بیشتر با هم ترکیب شدند. مجموعه حاصل سپس با استفاده از کیت واکنشگر NovaSeq S2 (1 × 100 نوکلئوتید) با بارگذاری 2 نانومولار (4٪ PhiX) در حالت استاندارد روی دستگاه NovaSeq 6000 توالی‌یابی شد.
خط لوله ما بر اساس خط لوله تحلیل داده‌های QuantSeq Pool شرکت Lexogen (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis) است. داده‌ها ابتدا با استفاده از bcl2fastq2 (نسخه 2.20.0) بر اساس شاخص i7/i5 دی‌مالتی‌پلکس شدند. سپس، خوانش 2 با استفاده از idemux (نسخه 0.1.6) بر اساس بارکد نمونه i1 دی‌مالتی‌پلکس شد و توالی‌های UMI با استفاده از umi_tools (نسخه 1.0.1) استخراج شدند. سپس خوانش‌ها با استفاده از cutadapt (نسخه 3.4) در چندین دور کوتاه شدند تا خوانش‌های کوتاه (با طول کمتر از 20) یا خوانش‌هایی که صرفاً از توالی‌های آداپتور تشکیل شده بودند، حذف شوند. سپس خوانش‌ها با استفاده از STAR (نسخه 2.6.0c) با ژنوم انسان هم‌تراز شدند و فایل‌های BAM با SAMtools (نسخه 1.11) ایندکس شدند. خوانش‌های تکراری با استفاده از umi_tools (نسخه 1.0.1) حذف شدند. در نهایت، شمارش هم‌ترازی با استفاده از featureCounts در Subread (نسخه ۲.۰.۳) انجام شد. کنترل کیفیت با استفاده از FastQC (نسخه ۰.۱۱.۹) در چندین مرحله میانی از خط تولید انجام شد.
تمام پردازش‌ها و مصورسازی‌های بیوانفورماتیکی بیشتر در R (نسخه 4.2.3) و عمدتاً با استفاده از گردش کار Seurat (نسخه 4.4.0) انجام شد. 83 بنابراین، مقادیر UMI منفرد و ماتریس‌های فراداده به اشیاء Seurat تبدیل شدند. ژن‌هایی که در کمتر از 30٪ از کل فیبرها بیان شده بودند، حذف شدند. نمونه‌های کم‌کیفیت بر اساس حداقل آستانه 1000 مقدار UMI و 1000 ژن شناسایی شده حذف شدند. در نهایت، 925 فیبر از تمام مراحل فیلتر کنترل کیفیت عبور کردند. مقادیر UMI با استفاده از روش Seurat SCTransform نسخه 2 نرمال‌سازی شدند، 84 مورد شامل تمام 7418 ویژگی شناسایی شده، و تفاوت‌های بین شرکت‌کنندگان از بین رفت. تمام فراداده‌های مربوطه را می‌توان در مجموعه داده‌های تکمیلی 28 یافت.