اثر ضد بیوفیلم و تحریک بهبود پانسمان‌های نیترات نقره

از بازدید شما از Nature.com متشکریم. نسخه مرورگری که استفاده می‌کنید پشتیبانی محدودی از CSS دارد. برای بهترین نتیجه، توصیه می‌کنیم از نسخه جدیدتر مرورگر خود استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در Internet Explorer غیرفعال کنید). در عین حال، برای اطمینان از پشتیبانی مداوم، سایت را بدون استایل یا جاوا اسکریپت نمایش می‌دهیم.
رشد میکروبی در زخم‌ها اغلب به صورت بیوفیلم ظاهر می‌شود که در بهبود زخم اختلال ایجاد می‌کند و ریشه‌کن کردن آن دشوار است. پانسمان‌های نقره جدید ادعا می‌کنند که با عفونت‌های زخم مبارزه می‌کنند، اما اثربخشی ضد بیوفیلم و اثرات بهبودی مستقل از عفونت آنها عموماً ناشناخته است. با استفاده از مدل‌های بیوفیلم استافیلوکوکوس اورئوس و سودوموناس آئروژینوزا در شرایط آزمایشگاهی (in vitro) و درون تنی (in vivo)، اثربخشی پانسمان‌های تولیدکننده یون Ag1+ را گزارش می‌کنیم؛ پانسمان‌های Ag1+ حاوی اتیلن دی آمین تترا استیک اسید و بنزتونیوم کلرید (Ag1+/EDTA/BC) و پانسمان‌های حاوی نیترات نقره (Ag oxysalts) که یون‌های Ag1+، Ag2+ و Ag3+ را برای مبارزه با بیوفیلم زخم و تأثیر آن بر بهبود زخم تولید می‌کنند. پانسمان‌های Ag1+ در شرایط آزمایشگاهی و در موش‌ها (C57BL/6j) اثرات حداقلی بر بیوفیلم زخم داشتند. در مقابل، نمک‌های نقره اکسیژن‌دار و پانسمان‌های Ag1+/EDTA/BC به طور قابل توجهی تعداد باکتری‌های زنده در بیوفیلم‌ها را در شرایط آزمایشگاهی کاهش دادند و کاهش قابل توجهی در اجزای باکتریایی و EPS در بیوفیلم‌های زخم موش نشان دادند. این پانسمان‌ها اثرات متفاوتی بر بهبود زخم‌های آلوده به بیوفیلم و غیر آلوده به بیوفیلم داشتند، به طوری که پانسمان‌های نمک اکسیژن‌دار در مقایسه با تیمارهای کنترل و سایر پانسمان‌های نقره، اثرات مفیدتری بر اپیتلیالیزاسیون مجدد، اندازه زخم و التهاب داشتند. خواص فیزیکوشیمیایی مختلف پانسمان‌های نقره ممکن است اثرات متفاوتی بر بیوفیلم و بهبود زخم داشته باشد و این موضوع باید هنگام انتخاب پانسمان برای درمان زخم‌های آلوده به بیوفیلم در نظر گرفته شود.
زخم‌های مزمن به عنوان «زخم‌هایی که مراحل طبیعی بهبودی را به طور منظم و به موقع طی نمی‌کنند» تعریف می‌شوند.1 زخم‌های مزمن بار روانی، اجتماعی و اقتصادی را برای بیماران و سیستم مراقبت‌های بهداشتی ایجاد می‌کنند. هزینه‌های سالانه NHS برای درمان زخم‌ها و بیماری‌های همراه مرتبط در سال‌های 2017-2018، 8.3 میلیارد پوند تخمین زده شده است. زخم‌های مزمن در حال حاضر نیز یک مشکل اساسی در ایالات متحده هستند، به طوری که مدیکر هزینه سالانه درمان بیماران مبتلا به زخم را 28.1 تا 96.8 میلیارد دلار تخمین زده است.3
عفونت عامل اصلی جلوگیری از بهبود زخم است. عفونت‌ها اغلب به صورت بیوفیلم ظاهر می‌شوند که در 78٪ از زخم‌های مزمن التیام نیافته وجود دارند. بیوفیلم‌ها زمانی تشکیل می‌شوند که میکروارگانیسم‌ها به طور برگشت‌ناپذیر به سطوحی مانند سطوح زخم متصل می‌شوند و می‌توانند تجمع یافته و جوامع تولیدکننده پلیمر خارج سلولی (EPS) را تشکیل دهند. بیوفیلم زخم با افزایش پاسخ التهابی مرتبط است که منجر به آسیب بافتی می‌شود و می‌تواند بهبود را به تأخیر بیندازد یا از آن جلوگیری کند. افزایش آسیب بافتی ممکن است تا حدی به دلیل افزایش فعالیت متالوپروتئینازهای ماتریکس، کلاژناز، الاستاز و گونه‌های فعال اکسیژن باشد. علاوه بر این، سلول‌های التهابی و بیوفیلم‌ها خود مصرف‌کننده‌های زیادی از اکسیژن هستند و بنابراین می‌توانند باعث هیپوکسی موضعی بافت شوند و اکسیژن حیاتی مورد نیاز سلول‌ها برای ترمیم مؤثر بافت را کاهش دهند.
بیوفیلم‌های بالغ در برابر عوامل ضدمیکروبی بسیار مقاوم هستند و برای کنترل عفونت‌های بیوفیلمی به استراتژی‌های تهاجمی مانند درمان مکانیکی و به دنبال آن درمان ضدمیکروبی مؤثر نیاز دارند. از آنجا که بیوفیلم‌ها می‌توانند به سرعت بازسازی شوند، داروهای ضدمیکروبی مؤثر می‌توانند خطر تشکیل مجدد پس از دبریدمان جراحی را کاهش دهند.
نقره به طور فزاینده‌ای در پانسمان‌های ضدمیکروبی استفاده می‌شود و اغلب به عنوان درمان خط اول برای زخم‌های عفونی مزمن به کار می‌رود. پانسمان‌های نقره تجاری زیادی وجود دارند که هر کدام حاوی ترکیب، غلظت و ماتریس پایه نقره متفاوتی هستند. پیشرفت در ساخت بازوبندهای نقره منجر به توسعه بازوبندهای نقره جدید شده است. شکل فلزی نقره (Ag0) بی‌اثر است. برای دستیابی به اثربخشی ضدمیکروبی، باید یک الکترون از دست بدهد تا نقره یونی (Ag1+) تشکیل شود. پانسمان‌های نقره سنتی حاوی ترکیبات نقره یا نقره فلزی هستند که در صورت قرار گرفتن در معرض مایع، تجزیه می‌شوند و یون‌های Ag1+ را تشکیل می‌دهند. این یون‌های Ag1+ با سلول باکتری واکنش می‌دهند و الکترون‌ها را از اجزای ساختاری یا فرآیندهای حیاتی لازم برای بقا حذف می‌کنند. فناوری ثبت اختراع منجر به توسعه یک ترکیب نقره جدید، اکسی‌سالت‌های Ag (نیترات نقره، Ag7NO11) شده است که در پانسمان‌های زخم وجود دارد. برخلاف نقره سنتی، تجزیه نمک‌های حاوی اکسیژن، حالت‌هایی از نقره با ظرفیت بالاتر (Ag1+، Ag2+ و Ag3+) تولید می‌کند. مطالعات آزمایشگاهی نشان داده‌اند که غلظت‌های پایین نمک‌های نقره اکسیژن‌دار در مقایسه با نقره تک یونی (Ag1+) در برابر باکتری‌های بیماری‌زا مانند سودوموناس آئروژینوزا، استافیلوکوکوس اورئوس و اشریشیا کلی مؤثرتر هستند. 8،9 نوع جدید دیگری از پانسمان نقره شامل ترکیبات اضافی، یعنی اتیلن دی آمین تترا استیک اسید (EDTA) و بنزتونیوم کلرید (BC) است که گزارش شده است EPS بیوفیلم را هدف قرار می‌دهند و در نتیجه نفوذ نقره را به بیوفیلم افزایش می‌دهند. این فناوری‌های جدید نقره، روش‌های جدیدی را برای هدف قرار دادن بیوفیلم‌های زخم ارائه می‌دهند. با این حال، تأثیر این مواد ضدمیکروبی بر محیط زخم و بهبود مستقل از عفونت مهم است تا اطمینان حاصل شود که آنها محیط زخم نامطلوبی ایجاد نمی‌کنند یا بهبود را به تأخیر نمی‌اندازند. نگرانی‌هایی در مورد سمیت سلولی نقره در شرایط آزمایشگاهی با چندین پانسمان نقره گزارش شده است10،11. با این حال، سمیت سلولی در شرایط آزمایشگاهی هنوز به سمیت در داخل بدن تبدیل نشده است و چندین پانسمان Ag1+ مشخصات ایمنی خوبی را نشان داده‌اند12.
در اینجا، ما اثربخشی پانسمان‌های کربوکسی متیل سلولز حاوی فرمولاسیون‌های جدید نقره را در برابر بیوفیلم زخم در شرایط آزمایشگاهی (in vitro) و درون تنی (in vivo) بررسی کردیم. علاوه بر این، اثرات این پانسمان‌ها بر پاسخ‌های ایمنی و بهبودی مستقل از عفونت ارزیابی شد.
تمام پانسمان‌های مورد استفاده به صورت تجاری موجود بودند. پانسمان فیبر ژلی Kerracel 3M (3M، ناتسفورد، انگلستان) یک پانسمان فیبر ژلی 100٪ کربوکسی متیل سلولز (CMC) غیر ضد میکروبی است که به عنوان پانسمان کنترل در این مطالعه استفاده شد. سه پانسمان نقره CMC ضد میکروبی، یعنی پانسمان Kerracel Ag 3M (3M، ناتسفورد، انگلستان) که حاوی 1.7 درصد وزنی نمک نقره اکسیژن‌دار (Ag7NO11) در یون‌های نقره با ظرفیت بالاتر (Ag1+، Ag2+ و Ag3+) است، مورد ارزیابی قرار گرفتند. در طول تجزیه Ag7NO11، یون‌های Ag1+، Ag2+ و Ag3+ با نسبت 1:2:4 تشکیل می‌شوند. پانسمان آکواسل آگ اکسترا حاوی ۱.۲٪ کلرید نقره (Ag1+) (ConvaTec، Deeside، انگلستان) ۱۳ و پانسمان آکواسل آگ اکسترا حاوی ۱.۲٪ کلرید نقره (Ag1+)، EDTA و بنزتونیوم کلرید (ConvaTec، Deeside، انگلستان) ۱۴.
سویه‌های مورد استفاده در این مطالعه، سودوموناس آئروژینوزا NCTC 10781 (اداره بهداشت عمومی انگلستان، سالزبری) و استافیلوکوکوس اورئوس NCTC 6571 (اداره بهداشت عمومی انگلستان، سالزبری) بودند.
باکتری‌ها یک شب در محیط کشت مولر-هینتون (Oxoid، Altrincham، انگلستان) کشت داده شدند. سپس کشت یک شبه در محیط کشت مولر-هینتون به نسبت ۱:۱۰۰ رقیق شد و ۲۰۰ میکرولیتر از آن روی غشاهای استریل ۰.۲ میکرومتری Whatman cyclopore (Whatman plc، Maidstone، انگلستان) روی پلیت‌های آگار مولر-هینتون (Sigma-Aldrich Company Ltd، کنت، بریتانیای کبیر) کشت داده شد. تشکیل بیوفیلم کلونی در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد به مدت ۲۴ ساعت. این بیوفیلم‌های کلونی از نظر انقباض لگاریتمی آزمایش شدند.
پانسمان را به قطعات مربعی ۳ سانتی‌متر مربع برش داده و با آب دیونیزه استریل از قبل مرطوب کنید. باند را روی بیوفیلم کلنی روی پلیت آگار قرار دهید. هر ۲۴ هکتار بیوفیلم برداشته شد و باکتری‌های زنده درون بیوفیلم (CFU/ml) با رقیق‌سازی سریالی (۱۰-۱ تا ۱۰-۷) در محیط کشت خنثی‌سازی Day-Angle (Merck-Millipore) تعیین مقدار شدند. پس از ۲۴ ساعت انکوباسیون در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد، شمارش استاندارد پلیت روی پلیت‌های آگار مولر-هینتون انجام شد. هر تیمار و هر نقطه زمانی در سه تکرار انجام شد و شمارش پلیت برای هر رقت تکرار شد.
پوست شکم خوک از خوک‌های سفید بزرگ ماده ظرف ۱۵ دقیقه پس از کشتار، مطابق با استانداردهای صادرات اتحادیه اروپا، تهیه می‌شود. پوست تراشیده و با دستمال‌های الکلی تمیز شد، سپس به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۸۰- درجه سانتیگراد منجمد شد تا پوست از بین برود. پس از ذوب شدن، قطعات پوست ۱ سانتی‌متر مربعی سه بار با PBS، ۰.۶٪ هیپوکلریت سدیم و ۷۰٪ اتانول هر بار به مدت ۲۰ دقیقه شسته شدند. قبل از برداشتن اپیدرم، اتانول باقی مانده را با ۳ بار شستشو در PBS استریل پاک کنید. پوست در یک پلیت ۶ چاهکی با یک غشای نایلونی به ضخامت ۰.۴۵ میکرومتر (Merck-Millipore) در بالا و ۳ پد جاذب (Merck-Millipore) حاوی ۳ میلی‌لیتر سرم جنین گاوی (Sigma) به همراه ۱۰٪ محیط کشت اصلاح‌شده Dulbecco's (Dulbecco's Modified Eagle Medium – Aldrich Ltd.) کشت داده شد.
بیوفیلم‌های کلونیایی همانطور که برای مطالعات مواجهه با بیوفیلم شرح داده شده است، رشد داده شدند. پس از کشت بیوفیلم روی غشاء به مدت ۷۲ ساعت، بیوفیلم با استفاده از یک حلقه تلقیح استریل روی سطح پوست قرار داده شد و غشاء برداشته شد. سپس بیوفیلم به مدت ۲۴ ساعت دیگر در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد روی درم خوک انکوبه شد تا بیوفیلم بالغ شود و به پوست خوک بچسبد. پس از بالغ شدن و اتصال بیوفیلم، یک پانسمان ۱.۵ سانتی‌متر مربعی که از قبل با آب مقطر استریل مرطوب شده بود، مستقیماً روی سطح پوست اعمال شد و به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد انکوبه شد. باکتری‌های زنده با رنگ‌آمیزی با استفاده یکنواخت از معرف زنده ماندن سلول PrestoBlue (Invitrogen، Life Technologies، Paisley، UK) به سطح رأسی هر ریزنمونه و انکوبه کردن آن به مدت ۵ دقیقه، قابل مشاهده شدند. از دوربین دیجیتال Leica DFC425 برای ثبت فوری تصاویر روی میکروسکوپ Leica MZ8 استفاده کنید. نواحی صورتی رنگ با استفاده از نرم‌افزار Image Pro نسخه 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD Image-Pro (mediacy.com)) تعیین کمیت شدند. میکروسکوپ الکترونی روبشی به شرح زیر انجام شد.
باکتری‌های رشد یافته در طول شب به نسبت ۱:۱۰۰ در محیط کشت مولر-هینتون رقیق شدند. ۲۰۰ میکرولیتر از کشت به غشای استریل واتمن سیکلوپور ۰.۲ میکرومتری (واتمن، میدستون، انگلستان) اضافه شد و روی آگار مولر-هینتون کشت داده شد. پلیت‌های بیوفیلم به مدت ۷۲ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد انکوبه شدند تا بیوفیلم بالغ تشکیل شود.
پس از ۳ روز بلوغ بیوفیلم، یک بانداژ مربعی ۳ سانتی‌متر مربعی مستقیماً روی بیوفیلم قرار داده شد و به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد انکوبه شد. پس از برداشتن بانداژ از سطح بیوفیلم، ۱ میلی‌لیتر از معرف زنده‌مانی سلولی PrestoBlue (Invitrogen، Waltham، MA) به مدت ۲۰ ثانیه به سطح هر بیوفیلم اضافه شد. سطوح قبل از ثبت تغییرات رنگ با استفاده از دوربین دیجیتال Nikon D2300 (Nikon UK Ltd.، Kingston، UK) خشک شدند.
کشت‌های شبانه را روی محیط کشت مولر-هینتون آگار تهیه کنید، کلونی‌های منفرد را به 10 میلی‌لیتر محیط کشت مولر-هینتون منتقل کنید و روی شیکر در دمای 37 درجه سانتیگراد (100 دور در دقیقه) انکوبه کنید. پس از انکوباسیون شبانه، کشت به نسبت 1:100 در محیط کشت مولر-هینتون رقیق شد و 300 میکرولیتر از آن روی غشای سیکلوپور واتمن دایره‌ای 0.2 میکرومتری (واتمن بین‌المللی، میدستون، انگلستان) روی آگار مولر-هینتون قرار داده شد و ظرف 72 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شد. بیوفیلم بالغ طبق توضیحات زیر روی زخم اعمال شد.
تمام کارها با حیوانات در دانشگاه منچستر تحت مجوز پروژه‌ای که توسط دفتر رفاه حیوانات و بررسی اخلاقی (P8721BD27) تأیید شده است و مطابق با دستورالعمل‌های منتشر شده توسط وزارت کشور تحت ASPA اصلاح شده در سال ۲۰۱۲ انجام شد. همه نویسندگان به دستورالعمل‌های ورود پایبند بودند. موش‌های هشت هفته‌ای C57BL/6j (Envigo، Oxon، انگلستان) برای تمام مطالعات درون‌تنی استفاده شدند. موش‌ها با ایزوفلوران (Piramal Critical Care Ltd، West Drayton، انگلستان) بی‌هوش شدند و سطوح پشتی آنها تراشیده و تمیز شد. سپس با استفاده از پانچ بیوپسی Stiefel (Schuco International، Hertfordshire، انگلستان) یک زخم برشی به ابعاد ۲ × ۶ میلی‌متر به هر موش داده شد. برای زخم‌های آلوده به بیوفیلم، بلافاصله پس از آسیب، بیوفیلم کلونی ۷۲ ساعته رشد یافته روی غشاء را طبق توضیحات بالا با استفاده از یک حلقه تلقیح استریل روی لایه پوستی زخم بمالید و غشاء را دور بیندازید. یک سانتی‌متر مربع از پانسمان با آب استریل از قبل مرطوب می‌شود تا محیط زخم مرطوب بماند. پانسمان‌ها مستقیماً روی هر زخم قرار داده شدند و با فیلم 3M Tegaderm (3M، Bracknell، انگلستان) و چسب مایع Mastisol (Eloquest Healthcare، Ferndale، MI) که در اطراف لبه‌ها برای ایجاد چسبندگی بیشتر استفاده شده بود، پوشانده شدند. بوپرنورفین (Animalcare، York، انگلستان) با غلظت 0.1 میلی‌گرم بر کیلوگرم به عنوان مسکن تجویز شد. موش‌ها را سه روز پس از آسیب با استفاده از روش برنامه 1 جمع‌آوری کنید و در صورت نیاز، ناحیه زخم را جدا، نصف و ذخیره کنید.
رنگ‌آمیزی هماتوکسیلین (ThermoFisher Scientific) و ائوزین (ThermoFisher Scientific) طبق پروتکل سازنده انجام شد. مساحت زخم و اپیتلیالیزاسیون مجدد با استفاده از نرم‌افزار Image Pro نسخه 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD) اندازه‌گیری شد.
بخش‌های بافتی در زایلن (ThermoFisher Scientific، Loughborough، انگلستان) موم‌زدایی شدند، با اتانول درجه‌بندی شده ۱۰۰-۵۰٪ دوباره هیدراته شدند و به مدت کوتاهی در آب دیونیزه (ThermoFisher Scientific) غوطه‌ور شدند. ایمونوهیستوشیمی با استفاده از کیت VectaStain Elite ABC PK-6104 (Vector Laboratories، Burlingame، CA) طبق پروتکل سازنده انجام شد. آنتی‌بادی‌های اولیه علیه نوتروفیل‌ها NIMP-R14 (Thermofisher Scientific) و ماکروفاژها Ms CD107b Pure M3/84 (BD Biosciences، Wokingham، انگلستان) در محلول مسدودکننده به نسبت ۱:۱۰۰ رقیق شده و به سطح برش اضافه شدند، و پس از آن ۲ آنتی‌بادی Anti-، VectaStain ABC و کیت سوبسترای Vector Nova Red Peroxidase (HRP) (Vector Laboratories، Burlingame، CA) اضافه و با هماتوکسیلین رنگ‌آمیزی متقابل شدند. تصاویر با استفاده از میکروسکوپ Olympus BX43 و دوربین دیجیتال Olympus DP73 (Olympus، Southend-on-Sea، انگلستان) گرفته شدند.
نمونه‌های پوست به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۴ درجه سانتیگراد در محلول گلوتارآلدئید ۲.۵٪ و فرمالدئید ۴٪ در محلول ۰.۱ مولار HEPES (pH 7.4) تثبیت شدند. نمونه‌ها با استفاده از اتانول درجه‌بندی شده آبگیری و با استفاده از خشک‌کن نقطه بحرانی Quorum K850 (Quorum Technologies Ltd، Loughton، انگلستان) در CO2 خشک شدند و با استفاده از سیستم کوچک کندوپاش/تخلیه نور Quorum SC7620 با آلیاژ طلا-پالادیوم پوشش داده شدند. نمونه‌ها با استفاده از میکروسکوپ الکترونی روبشی FEI Quanta 250 (ThermoFisher Scientific) تصویربرداری شدند تا نقطه مرکزی زخم قابل مشاهده باشد.
یدید Toto-1 (2 میکرومولار) روی سطح زخم موش برداشته شده اعمال شد و به مدت 5 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد (ThermoFisher Scientific) انکوبه شد و با Syto-60 (10 میکرومولار) در دمای 37 درجه سانتیگراد (ThermoFisher Scientific) تیمار شد. تصاویر Z-stack 15 دقیقه‌ای با استفاده از Leica TCS SP8 ایجاد شدند.
داده‌های تکرار بیولوژیکی و فنی با استفاده از نرم‌افزار Graphpad Prism V9 (نرم‌افزار GraphPad، لا هویا، کالیفرنیا) جدول‌بندی و تجزیه و تحلیل شدند. از آنالیز واریانس یک‌طرفه با مقایسه‌های چندگانه با استفاده از آزمون تعقیبی دانت برای بررسی تفاوت‌های بین هر تیمار و پانسمان کنترل غیر ضدمیکروبی استفاده شد. مقدار p <0.05 معنی‌دار در نظر گرفته شد.
اثربخشی پانسمان‌های فیبری ژل نقره ابتدا در برابر کلونی‌های بیوفیلم استافیلوکوکوس اورئوس و سودوموناس آئروژینوزا در شرایط آزمایشگاهی (in vitro) ارزیابی شد. پانسمان‌های نقره حاوی فرمول‌های مختلفی از نقره هستند: پانسمان‌های نقره سنتی یون‌های Ag1+ تولید می‌کنند؛ پانسمان‌های نقره که می‌توانند پس از افزودن EDTA/BC یون‌های Ag1+ تولید کنند، می‌توانند ماتریکس بیوفیلم را از بین ببرند و باکتری‌ها را تحت اثر ضد باکتریایی یون‌های نقره در معرض نقره قرار دهند.15 و پانسمان‌های حاوی نمک‌های نقره اکسیژن‌دار که یون‌های Ag1+، Ag2+ و Ag3+ تولید می‌کنند. اثربخشی آن با یک پانسمان کنترل غیر ضد میکروبی ساخته شده از الیاف ژلی مقایسه شد. باکتری‌های زنده باقی مانده در بیوفیلم هر 24 ساعت به مدت 8 روز ارزیابی شدند (شکل 1). در روز 5، بیوفیلم با 3.85 × 105S. استافیلوکوکوس اورئوس یا 1.22 × 105S. برای ارزیابی بازیابی بیوفیلم، مجدداً تلقیح شد. در مقایسه با پانسمان‌های کنترل غیر ضدمیکروبی، پانسمان‌های Ag1+ در طول 5 روز تأثیر کمی بر زنده‌مانی باکتری‌ها در بیوفیلم‌های استافیلوکوکوس اورئوس و سودوموناس آئروژینوزا داشتند. در مقابل، پانسمان‌های حاوی نمک‌های Ag اکسیژن‌دار و Ag1+ + EDTA/BC در کشتن باکتری‌های درون بیوفیلم در عرض 5 روز مؤثر بودند. پس از تلقیح مکرر با باکتری‌های پلانکتونی در روز 5، هیچ گونه ترمیمی در بیوفیلم مشاهده نشد (شکل 1).
تعیین کمیت باکتری‌های زنده در بیوفیلم‌های استافیلوکوکوس اورئوس و سودوموناس آئروژینوزا پس از تیمار با پانسمان نقره. کلونی‌های بیوفیلم استافیلوکوکوس اورئوس و سودوموناس آئروژینوزا با پانسمان نقره یا پانسمان‌های کنترل غیر ضدمیکروبی تیمار شدند و تعداد باکتری‌های زنده باقی‌مانده هر 24 ساعت تعیین شد. پس از 5 روز، بیوفیلم با 3.85×105S. استافیلوکوکوس اورئوس یا 1.22×105P. دوباره تلقیح شد. کلونی‌های باکتریوپلانکتون سودوموناس آئروژینوزا به صورت جداگانه برای ارزیابی بازیابی بیوفیلم تشکیل شدند. نمودارها میانگین +/- خطای استاندارد را نشان می‌دهند.
برای تجسم تأثیر پانسمان‌های نقره بر زنده‌مانی بیوفیلم، پانسمان‌ها بر روی بیوفیلم‌های بالغ رشد یافته روی پوست خوک به صورت ex vivo اعمال شدند. پس از 24 ساعت، پانسمان برداشته می‌شود و بیوفیلم با یک رنگ واکنشی آبی رنگ‌آمیزی می‌شود که توسط باکتری‌های زنده به رنگ صورتی متابولیزه می‌شود. بیوفیلم‌های تیمار شده با پانسمان‌های کنترل صورتی بودند که نشان دهنده وجود باکتری‌های زنده در بیوفیلم است (شکل 2A). در مقابل، بیوفیلم تیمار شده با پانسمان Ag oxysols عمدتاً آبی بود که نشان می‌دهد باکتری‌های باقی مانده روی سطح پوست خوک، باکتری‌های غیرزنده هستند (شکل 2B). رنگ‌آمیزی ترکیبی آبی و صورتی در بیوفیلم‌های تیمار شده با پانسمان‌های حاوی Ag1+ مشاهده شد که نشان دهنده وجود باکتری‌های زنده و غیرزنده در بیوفیلم است (شکل 2C)، در حالی که پانسمان‌های EDTA/BC حاوی Ag1+ عمدتاً آبی با برخی لکه‌های صورتی بودند که نشان دهنده مناطقی است که تحت تأثیر پانسمان نقره قرار نگرفته‌اند (شکل 2D). کمی‌سازی نواحی فعال (صورتی) و غیرفعال (آبی) نشان داد که پچ کنترل 75٪ فعال بوده است (شکل 2E). پانسمان‌های Ag1+ + EDTA/BC مشابه پانسمان‌های نمک نقره اکسیژن‌دار عمل کردند و به ترتیب 13٪ و 14٪ زنده ماندند. پانسمان Ag1+ همچنین 21٪ از زیست‌پذیری باکتری‌ها را کاهش داد. سپس این بیوفیلم‌ها با استفاده از میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) مشاهده شدند. پس از تیمار با پانسمان کنترل و پانسمان Ag1+، لایه‌ای از سودوموناس آئروژینوزا مشاهده شد که پوست خوک را پوشانده بود (شکل 2F، H)، در حالی که پس از تیمار با پانسمان Ag1+، تعداد کمی سلول باکتریایی و تعداد کمی سلول باکتریایی در زیر آن یافت شد. الیاف کلاژن را می‌توان به عنوان ساختار بافت پوست خوک در نظر گرفت (شکل 2G). پس از تیمار با پانسمان Ag1+ + EDTA/BC، پلاک‌های باکتریایی و پلاک‌های فیبر کلاژن زیرین قابل مشاهده بودند (شکل 2I).
تجسم بیوفیلم سودوموناس آئروژینوزا پس از تیمار با پانسمان نقره. (A-D) زیست‌پذیری باکتری در بیوفیلم‌های سودوموناس آئروژینوزا رشد یافته روی پوست خوک با استفاده از رنگ زیست‌پذیری PrestoBlue 24 ساعت پس از تیمار با پانسمان نقره یا پانسمان کنترل غیر ضد میکروبی مشاهده شد. باکتری‌های زنده صورتی، باکتری‌های غیر زنده و پوست خوک آبی هستند. (E) کمی‌سازی بیوفیلم‌های سودوموناس آئروژینوزا رشد یافته روی پوست خوک (لکه صورتی) با استفاده از میکروسکوپ الکترونی روبشی Image Pro نسخه 10 (FI) و تیمار شده با پانسمان نقره یا پانسمان کنترل غیر ضد میکروبی به مدت 24 ساعت. نوار مقیاس SEM = 5 میکرومتر. (J-M) بیوفیلم‌های کلونی روی فیلترها رشد کردند و پس از 24 ساعت انکوباسیون با پانسمان نقره با رنگ واکنشی PrestoBlue رنگ‌آمیزی شدند.
برای تعیین اینکه آیا تماس نزدیک بین پانسمان‌ها و بیوفیلم‌ها بر اثربخشی پانسمان‌ها تأثیر می‌گذارد یا خیر، بیوفیلم‌های کلونی که روی یک سطح صاف قرار داده شده بودند، به مدت ۲۴ ساعت با پانسمان‌ها تیمار شده و سپس با رنگ‌های واکنشی رنگ‌آمیزی شدند. بیوفیلم تیمار نشده به رنگ صورتی تیره بود (شکل ۲J). برخلاف بیوفیلم‌های تیمار شده با پانسمان‌های حاوی نمک‌های اکسیژن‌دار Ag (شکل ۲K)، بیوفیلم‌های تیمار شده با پانسمان‌های حاوی Ag1+ یا Ag1+ + EDTA/BC نوارهایی از رنگ‌آمیزی صورتی را نشان دادند (شکل ۲L، M). این رنگ صورتی نشان دهنده وجود باکتری‌های زنده است و با ناحیه بخیه درون پانسمان مرتبط است. این نواحی دوخته شده فضاهای مرده‌ای ایجاد می‌کنند که به باکتری‌های درون بیوفیلم اجازه زنده ماندن می‌دهند.
برای ارزیابی اثربخشی پانسمان‌های نقره در داخل بدن (in vivo)، زخم‌های تمام ضخامت موش‌های آلوده به بیوفیلم‌های بالغ S. aureus و P. aeruginosa با پانسمان‌های کنترل غیر ضدمیکروبی یا پانسمان‌های نقره درمان شدند. پس از 3 روز درمان، تجزیه و تحلیل تصویر ماکروسکوپی، اندازه زخم‌های کوچکتری را هنگام درمان با پانسمان‌های نمک اکسیژنه در مقایسه با پانسمان‌های کنترل غیر ضدمیکروبی و سایر پانسمان‌های نقره نشان داد (شکل 3A-H). برای تأیید این مشاهدات، زخم‌ها برداشت شدند و مساحت زخم و اپیتلیالیزاسیون مجدد بر روی مقاطع بافتی رنگ‌آمیزی شده با هماتوکسیلین و ائوزین با استفاده از نرم‌افزار image pro نسخه 10 تعیین شد (شکل 3I-L).
تأثیر پانسمان‌های نقره بر سطح زخم و بازسازی اپیتلیال زخم‌های آلوده به بیوفیلم. (A-H) سلول‌های کوچک آلوده به بیوفیلم‌های سودوموناس آئروژینوزا (A-D) و استافیلوکوکوس اورئوس (E-H) پس از سه روز درمان با یک پانسمان کنترل غیر ضد میکروبی، یک پانسمان نمکی Ag اکسیژن‌دار، یک پانسمان Ag1+ و یک پانسمان Ag1+. تصاویر ماکروسکوپی نمونه. زخم‌های موش‌ها با پانسمان Ag1+ + EDTA/BC. (IL) عفونت سودوموناس آئروژینوزا نمونه، مقاطع بافت‌شناسی رنگ‌آمیزی شده با هماتوکسیلین و ائوزین، مورد استفاده برای تعیین کمیت مساحت زخم و بازسازی اپیتلیال. تعیین کمیت مساحت زخم (M، O) و درصد بازسازی اپیتلیال (N، P) زخم‌های آلوده به بیوفیلم‌های سودوموناس آئروژینوزا (M، ​​N) و استافیلوکوکوس اورئوس (O، P) (به ازای هر گروه درمانی n = 12). نمودارها میانگین +/- خطای استاندارد را نشان می‌دهند. * یعنی p = < 0.05 ** یعنی p = < 0.01؛ مقیاس ماکروسکوپی = 2.5 میلی‌متر، مقیاس بافت‌شناسی = 500 میکرومتر.
کمی‌سازی مساحت زخم در زخم‌های آلوده به بیوفیلم سودوموناس آئروژینوزا (شکل 3M) نشان داد که زخم‌های درمان‌شده با اکسی‌سالت‌های نقره، اندازه متوسط ​​زخم 2.5 میلی‌متر مربع داشتند، در حالی که پانسمان کنترل غیر ضدمیکروبی، اندازه متوسط ​​زخم 3.1 میلی‌متر مربع داشت که درست نیست. به لحاظ آماری معنی‌دار بود (شکل 3M). p = 0.423). زخم‌های درمان‌شده با Ag1+ یا Ag1+ + EDTA/BC هیچ کاهشی در مساحت زخم نشان ندادند (به ترتیب 3.1 میلی‌متر مربع و 3.6 میلی‌متر مربع). درمان با پانسمان نمک نقره اکسیژن‌دار، اپیتلیالیزاسیون مجدد را به میزان بیشتری نسبت به پانسمان کنترل غیر ضدمیکروبی (به ترتیب 34٪ و 15٪؛ p = 0.029) و Ag1+ یا Ag1+ + EDTA/BC (به ترتیب 10٪ و 11٪) (شکل 3N) افزایش داد.
روندهای مشابهی در مساحت زخم و بازسازی اپیتلیال در زخم‌های آلوده به بیوفیلم‌های S. aureus مشاهده شد (شکل 3O). پانسمان‌های حاوی نمک‌های نقره اکسیژن‌دار، مساحت زخم (2.0 میلی‌متر مربع) را در مقایسه با پانسمان کنترل غیر ضدمیکروبی (2.6 میلی‌متر مربع) 23٪ کاهش دادند، اگرچه این کاهش معنی‌دار نبود (p = 0.304) (شکل 3O). علاوه بر این، مساحت زخم در گروه درمان Ag1+ کمی کاهش یافت (2.4 میلی‌متر مربع)، در حالی که زخم درمان شده با پانسمان Ag1+ + EDTA/BC مساحت زخم را کاهش نداد (2.9 میلی‌متر مربع). نمک‌های اکسیژن Ag همچنین باعث اپیتلیالیزاسیون مجدد زخم‌های آلوده به بیوفیلم S. aureus (31٪) به میزان بیشتری نسبت به زخم‌های درمان شده با پانسمان‌های کنترل غیر ضدمیکروبی (12٪، p = 0.003) شد (شکل 3P). پانسمان Ag1+ (16%، p = 0.903) و پانسمان Ag+1 + EDTA/BC (14%، p = 0.965) سطوح بازسازی اپیتلیال مشابه گروه کنترل را نشان دادند.
برای تجسم تأثیر پانسمان‌های نقره بر روی ماتریکس بیوفیلم، رنگ‌آمیزی یدید Toto 1 و Syto 60 انجام شد (شکل 4). یدید Toto 1 یک رنگ نفوذناپذیر به سلول است که می‌تواند برای تجسم دقیق اسیدهای نوکلئیک خارج سلولی که در EPS بیوفیلم‌ها فراوان هستند، استفاده شود. Syto 60 یک رنگ نفوذپذیر به سلول است که به عنوان رنگ‌آمیزی متقابل استفاده می‌شود16. مشاهدات یدید Toto 1 و Syto 60 در زخم‌های تلقیح شده با بیوفیلم‌های سودوموناس آئروژینوزا (شکل 4A-D) و استافیلوکوکوس اورئوس (شکل 4I-L) نشان داد که پس از 3 روز درمان با پانسمان، EPS در بیوفیلم به طور قابل توجهی کاهش یافته است. حاوی نمک‌های اکسیژن‌دار Ag و Ag1+ + EDTA/BC. پانسمان‌های Ag1+ بدون اجزای آنتی‌بیوفیلم اضافی، DNA بدون سلول را در زخم‌های تلقیح شده با سودوموناس آئروژینوزا به طور قابل توجهی کاهش دادند، اما در زخم‌های تلقیح شده با استافیلوکوکوس اورئوس کمتر مؤثر بودند.
تصویربرداری درون‌تنی از بیوفیلم زخم پس از ۳ روز درمان با پانسمان‌های کنترل یا نقره. تصاویر کانفوکال از سودوموناس آئروژینوزا (A-D) و استافیلوکوکوس اورئوس (I-L) رنگ‌آمیزی شده با Toto 1 (سبز) برای مشاهده اسیدهای نوکلئیک خارج سلولی، که جزئی از پلیمرهای بیوفیلم خارج سلولی هستند. برای رنگ‌آمیزی اسیدهای نوکلئیک داخل سلولی، از Syto 60 (قرمز) استفاده کنید. اسیدها. ص. میکروسکوپ الکترونی روبشی از زخم‌های آلوده به بیوفیلم‌های سودوموناس آئروژینوزا (E-H) و استافیلوکوکوس اورئوس (M-P) پس از ۳ روز درمان با پانسمان‌های کنترل و نقره. نوار مقیاس SEM = 5 میکرومتر. نوار مقیاس تصویربرداری کانفوکال = 50 میکرومتر.
میکروسکوپ الکترونی روبشی نشان داد که موش‌هایی که با کلونی‌های بیوفیلم سودوموناس آئروژینوزا (شکل 4E-H) و استافیلوکوکوس اورئوس (شکل 4M-P) تلقیح شده بودند، پس از 3 روز درمان با تمام پانسمان‌های نقره، باکتری‌های به طور قابل توجهی کمتری در زخم‌های خود داشتند.
برای ارزیابی تأثیر پانسمان‌های نقره بر التهاب زخم در موش‌های آلوده به بیوفیلم، بخش‌هایی از زخم‌های آلوده به بیوفیلم که به مدت 3 روز با پانسمان‌های کنترل یا پانسمان‌های نقره درمان شده بودند، با استفاده از آنتی‌بادی‌های اختصاصی برای نوتروفیل‌ها و ماکروفاژها، به روش ایمونوهیستوشیمی رنگ‌آمیزی شدند. تعیین کمی نوتروفیل‌ها و ماکروفاژها در داخل. بافت گرانولاسیون. شکل 5). همه پانسمان‌های نقره تعداد نوتروفیل‌ها و ماکروفاژها را در زخم‌های آلوده به سودوموناس آئروژینوزا در مقایسه با پانسمان‌های کنترل غیر ضد میکروبی پس از سه روز درمان کاهش دادند. با این حال، درمان با پانسمان نمک نقره اکسیژن‌دار منجر به کاهش بیشتر نوتروفیل‌ها (p = <0.0001) و ماکروفاژها (p = <0.0001) در مقایسه با سایر پانسمان‌های نقره آزمایش شده شد (شکل 5I، J). اگرچه Ag1+ + EDTA/BC تأثیر بیشتری بر بیوفیلم زخم داشت، اما سطح نوتروفیل‌ها و ماکروفاژها را به میزان کمتری نسبت به پانسمان Ag1+ کاهش داد. زخم‌های متوسط ​​آلوده به بیوفیلم S. aureus نیز پس از پانسمان با اکسیسول‌های Ag (p = <0.0001)، Ag1+ (p = 0.0008) و Ag1++ EDTA/BC (p = 0.0043) در مقایسه با گروه کنترل مشاهده شدند. روند مشابهی برای نوتروپنی مشاهده می‌شود. پانسمان (شکل 5K). با این حال، تنها پانسمان نمک Ag اکسیژن‌دار، کاهش قابل توجهی در تعداد ماکروفاژها در بافت گرانوله در مقایسه با گروه کنترل در زخم‌های آلوده به بیوفیلم‌های S. aureus نشان داد (p = 0.0339) (شکل 5L).
نوتروفیل‌ها و ماکروفاژها در زخم‌های آلوده به بیوفیلم‌های سودوموناس آئروژینوزا و استافیلوکوکوس اورئوس پس از 3 روز درمان با پانسمان‌های غیر ضدمیکروبی یا پانسمان‌های نقره، اندازه‌گیری شدند. نوتروفیل‌ها (AD) و ماکروفاژها (EH) در برش‌های بافتی رنگ‌آمیزی شده با آنتی‌بادی‌های اختصاصی برای نوتروفیل‌ها یا ماکروفاژها اندازه‌گیری شدند. اندازه‌گیری نوتروفیل‌ها (I و K) و ماکروفاژها (J و L) در زخم‌های آلوده به بیوفیلم‌های سودوموناس آئروژینوزا (I و J) و استافیلوکوکوس اورئوس (K & L). N = 12 در هر گروه. نمودارها میانگین +/- خطای استاندارد، مقادیر معنی‌داری را در مقایسه با پانسمان کنترل غیر ضدباکتریایی نشان می‌دهند، * به معنی p = < 0.05، ** به معنی p = < 0.01؛ *** به معنی p = < 0.001؛ نشان دهنده p = < 0.0001 است).
سپس تأثیر پانسمان‌های نقره را بر بهبود مستقل از عفونت ارزیابی کردیم. زخم‌های غیر عفونی با پانسمان کنترل غیر ضد میکروبی یا پانسمان نقره به مدت 3 روز درمان شدند (شکل 6). در میان پانسمان‌های نقره آزمایش شده، تنها زخم‌های درمان شده با پانسمان نمک اکسیژنه در تصاویر ماکروسکوپی کوچکتر از زخم‌های درمان شده با گروه کنترل به نظر می‌رسیدند (شکل 6A-D). کمی‌سازی مساحت زخم با استفاده از آنالیز بافت‌شناسی نشان داد که میانگین مساحت زخم پس از درمان با پانسمان اکسیسول‌های نقره 2.35 میلی‌متر مربع در مقایسه با 2.96 میلی‌متر مربع برای زخم‌های درمان شده با گروه کنترل بود، اما این تفاوت از نظر آماری معنی‌دار نبود (0.488 = p) (شکل 6I). در مقابل، پس از درمان با پانسمان‌های Ag1+ (3.38 میلی‌متر مربع، p = 0.757) یا Ag1+ + EDTA/BC (4.18 میلی‌متر مربع، p = 0.054) در مقایسه با گروه کنترل، هیچ کاهشی در مساحت زخم مشاهده نشد. افزایش بازسازی اپیتلیال با پانسمان اکسیسول نقره در مقایسه با گروه کنترل مشاهده شد (به ترتیب 30٪ در مقابل 22٪)، اگرچه این به معنی داری نرسید (0.067 = p)، اما کاملاً قابل توجه است و نتایج قبلی را تأیید می کند. پانسمان با اکسیسول ها باعث اپیتلیالیزاسیون مجدد می شود. - اپیتلیالیزاسیون زخم های غیر عفونی17. در مقابل، درمان با پانسمان های Ag1+ یا Ag1+ + EDTA/BC هیچ تاثیری نداشت یا کاهش اپیتلیالیزاسیون مجدد را در مقایسه با گروه کنترل نشان داد.
تأثیر پانسمان زخم نقره بر بهبود زخم در موش‌های غیرآلوده با برداشتن کامل زخم. (AD) تصاویر ماکروسکوپی نمونه از زخم‌ها پس از سه روز درمان با پانسمان کنترل غیر ضدمیکروبی و پانسمان نقره. (EH) مقاطع نمونه از زخم که با هماتوکسیلین و ائوزین رنگ‌آمیزی شده‌اند. تعیین کمی مساحت زخم (I) و درصد اپیتلیالیزاسیون مجدد (J) از مقاطع بافت‌شناسی در نقطه میانی زخم با استفاده از نرم‌افزار آنالیز تصویر محاسبه شد (n = 11-12 در هر گروه درمانی). نمودارها میانگین +/- خطای استاندارد را نشان می‌دهند. * به معنی p = <0.05 است.
نقره سابقه طولانی در استفاده به عنوان یک درمان ضد میکروبی در بهبود زخم دارد، اما فرمولاسیون‌ها و روش‌های مختلف تحویل آن ممکن است منجر به تفاوت در اثربخشی ضد میکروبی شود18. علاوه بر این، خواص ضد بیوفیلم سیستم‌های تحویل نقره خاص به طور کامل درک نشده است. اگرچه پاسخ ایمنی میزبان در برابر باکتری‌های پلانکتونی نسبتاً مؤثر است، اما عموماً در برابر بیوفیلم‌ها کمتر مؤثر است19. باکتری‌های پلانکتونی به راحتی توسط ماکروفاژها فاگوسیتوز می‌شوند، اما در بیوفیلم‌ها، سلول‌های تجمع یافته با محدود کردن پاسخ میزبان تا حدی که سلول‌های ایمنی بتوانند آپوپتوز را انجام دهند و فاکتورهای پیش التهابی را برای افزایش پاسخ ایمنی آزاد کنند، مشکلات بیشتری ایجاد می‌کنند20. مشاهده شده است که برخی از لکوسیت‌ها می‌توانند به بیوفیلم‌ها نفوذ کنند21 اما پس از به خطر افتادن این دفاع، قادر به فاگوسیتوز باکتری‌ها نیستند22. باید از یک رویکرد جامع برای پشتیبانی از پاسخ ایمنی میزبان در برابر عفونت بیوفیلم زخم استفاده شود. دبریدمان زخم می‌تواند از نظر فیزیکی بیوفیلم را مختل کرده و بیشتر بار زیستی را از بین ببرد، اما پاسخ ایمنی میزبان ممکن است در برابر بیوفیلم باقی مانده بی‌اثر باشد، به خصوص اگر پاسخ ایمنی میزبان به خطر بیفتد. بنابراین، درمان‌های ضدمیکروبی مانند پانسمان‌های نقره می‌توانند از پاسخ ایمنی میزبان پشتیبانی کرده و عفونت‌های بیوفیلم را از بین ببرند. ترکیب، غلظت، حلالیت و بستر انتقال می‌تواند بر اثربخشی ضدمیکروبی نقره تأثیر بگذارد. در سال‌های اخیر، پیشرفت در فناوری پردازش نقره، این پانسمان‌ها را مؤثرتر کرده است9،23. با پیشرفت فناوری پانسمان‌های نقره، درک اثربخشی این پانسمان‌ها در کنترل عفونت زخم و مهم‌تر از آن، تأثیر این اشکال قوی نقره بر محیط زخم و بهبود آن مهم است.
در این مطالعه، ما اثربخشی دو پانسمان نقره پیشرفته را با پانسمان‌های نقره معمولی که یون‌های Ag1+ را علیه بیوفیلم‌ها تولید می‌کنند، با استفاده از مدل‌های مختلف آزمایشگاهی (in vitro) و درون تنی (in vivo) مقایسه کردیم. ما همچنین تأثیر این پانسمان‌ها را بر محیط زخم و بهبودی مستقل از عفونت ارزیابی کردیم. برای به حداقل رساندن تأثیر ماتریکس دارورسانی، تمام پانسمان‌های نقره آزمایش شده از کربوکسی متیل سلولز تشکیل شده بودند.
ارزیابی اولیه ما از این پانسمان‌های نقره در برابر بیوفیلم‌های کلونی سودوموناس آئروژینوزا و استافیلوکوکوس اورئوس نشان می‌دهد که برخلاف پانسمان‌های سنتی Ag1+، دو پانسمان نقره پیشرفته، Ag1+ + EDTA/BC و نمک‌های اکسیژن‌دار Ag، در دمای 5 درجه سانتیگراد مؤثر هستند و به طور مؤثر باکتری‌های بیوفیلم را در عرض چند روز از بین می‌برند. علاوه بر این، این پانسمان‌ها از تشکیل مجدد بیوفیلم در صورت قرار گرفتن مکرر در معرض باکتری‌های پلانکتونی جلوگیری می‌کنند. پانسمان Ag1+ حاوی کلرید نقره، همان ترکیب نقره و ماتریس پایه Ag1+ + EDTA/BC بود و تأثیر محدودی بر زنده ماندن باکتری‌ها در بیوفیلم در همان دوره داشت. مشاهده اینکه پانسمان Ag1+ + EDTA/BC در برابر بیوفیلم مؤثرتر از پانسمان Ag1+ متشکل از همان ماتریس و یک ترکیب نقره بود، از این مفهوم پشتیبانی می‌کند که برای افزایش اثربخشی کلرید نقره در برابر بیوفیلم، همانطور که در جای دیگر گزارش شده است، به مواد اضافی نیاز است15. این نتایج از این ایده پشتیبانی می‌کنند که BC و EDTA نقش اضافی در اثربخشی کلی پانسمان ایفا می‌کنند و عدم وجود این جزء در پانسمان‌های Ag1+ ممکن است در عدم موفقیت در نشان دادن اثربخشی آزمایشگاهی (in vitro) نقش داشته باشد. ما دریافتیم که پانسمان‌های نمکی نقره اکسیژن‌دار که یون‌های Ag2+ و Ag3+ تولید می‌کنند، اثربخشی ضدباکتریایی قوی‌تری نسبت به Ag1+ و در سطوحی مشابه Ag1+ + EDTA/BC نشان می‌دهند. با این حال، به دلیل پتانسیل بالای اکسایش-کاهش، مشخص نیست که یون‌های Ag3+ تا چه مدت در برابر بیوفیلم‌های زخم فعال و مؤثر باقی می‌مانند و بنابراین شایسته مطالعه بیشتر هستند. علاوه بر این، پانسمان‌های مختلف زیادی وجود دارند که یون‌های Ag1+ تولید می‌کنند که در این مطالعه آزمایش نشدند. این پانسمان‌ها از ترکیبات، غلظت‌ها و ماتریس‌های پایه نقره مختلفی تشکیل شده‌اند که ممکن است بر انتقال یون‌های Ag1+ و اثربخشی آنها در برابر بیوفیلم‌ها تأثیر بگذارند. همچنین شایان ذکر است که مدل‌های مختلف آزمایشگاهی و درون تنی برای ارزیابی اثربخشی پانسمان‌های زخم در برابر بیوفیلم‌ها وجود دارد. نوع مدل مورد استفاده و همچنین محتوای نمک و پروتئین محیط مورد استفاده در این مدل‌ها، بر اثربخشی پانسمان تأثیر می‌گذارد. در مدل درون‌تنی خود، اجازه دادیم بیوفیلم در شرایط آزمایشگاهی بالغ شود و سپس آن را به سطح پوستی زخم منتقل کردیم. پاسخ ایمنی موش میزبان در برابر باکتری‌های پلانکتونی که روی زخم قرار گرفته‌اند نسبتاً مؤثر است و در نتیجه با بهبود زخم، بیوفیلم تشکیل می‌شود. افزودن بیوفیلم بالغ به زخم، اثربخشی پاسخ ایمنی میزبان به تشکیل بیوفیلم را محدود می‌کند، زیرا به بیوفیلم بالغ اجازه می‌دهد تا قبل از شروع بهبود، خود را در زخم مستقر کند. بنابراین، مدل ما به ما این امکان را می‌دهد که اثربخشی پانسمان‌های ضدمیکروبی را بر روی بیوفیلم‌های بالغ قبل از شروع بهبود زخم‌ها ارزیابی کنیم.
ما همچنین دریافتیم که تناسب پانسمان بر اثربخشی پانسمان‌های نقره بر بیوفیلم‌های رشد یافته در شرایط آزمایشگاهی و پوست خوک تأثیر می‌گذارد. تماس نزدیک با زخم برای اثربخشی ضدمیکروبی پانسمان بسیار مهم تلقی می‌شود24،25. پانسمان‌های حاوی نمک‌های نقره اکسیژن‌دار در تماس نزدیک با بیوفیلم‌های بالغ بودند و در نتیجه پس از 24 ساعت کاهش قابل توجهی در تعداد باکتری‌های زنده در بیوفیلم مشاهده شد. در مقابل، هنگامی که با پانسمان‌های Ag1+ و Ag1+ + EDTA/BC درمان شدند، تعداد قابل توجهی از باکتری‌های زنده باقی ماندند. این پانسمان‌ها حاوی بخیه‌هایی در طول کل پانسمان هستند که فضاهای مرده‌ای ایجاد می‌کنند که از تماس نزدیک با بیوفیلم جلوگیری می‌کنند. در مطالعات آزمایشگاهی ما، این نواحی غیرتماسی مانع از کشته شدن باکتری‌های زنده در بیوفیلم شدند. ما زنده ماندن باکتری‌ها را تنها پس از 24 ساعت درمان ارزیابی کردیم. با گذشت زمان، با اشباع شدن پانسمان، ممکن است فضای مرده کمتری وجود داشته باشد و مساحت این باکتری‌های زنده کاهش یابد. با این حال، این موضوع اهمیت ترکیب پانسمان را برجسته می‌کند، نه فقط نوع نقره موجود در پانسمان.
اگرچه مطالعات آزمایشگاهی (in vitro) برای مقایسه اثربخشی فناوری‌های مختلف نقره مفید هستند، اما درک اثرات این پانسمان‌ها بر بیوفیلم‌ها در داخل بدن (in vivo) نیز مهم است، جایی که بافت میزبان و پاسخ‌های ایمنی در اثربخشی پانسمان‌ها در برابر بیوفیلم‌ها نقش دارند. تأثیر این پانسمان‌ها بر بیوفیلم‌های زخم با استفاده از میکروسکوپ الکترونی روبشی و رنگ‌آمیزی EPS بیوفیلم با استفاده از رنگ‌های DNA درون سلولی و خارج سلولی مشاهده شد. ما دریافتیم که پس از 3 روز درمان، همه پانسمان‌ها در کاهش DNA بدون سلول در زخم‌های آلوده به بیوفیلم مؤثر بودند، اما پانسمان Ag1+ در زخم‌های آلوده به استافیلوکوکوس اورئوس کمتر مؤثر بود. میکروسکوپ الکترونی روبشی همچنین نشان داد که باکتری‌های به طور قابل توجهی کمتری در زخم‌های درمان شده با پانسمان‌های نقره وجود دارد، اگرچه این امر با پانسمان نمک نقره اکسیژن‌دار و پانسمان Ag1+ + EDTA/BC در مقایسه با پانسمان Ag1+ بارزتر بود. این داده‌ها نشان می‌دهند که پانسمان‌های نقره آزمایش‌شده درجات مختلفی از تأثیر را بر ساختار بیوفیلم داشته‌اند، اما هیچ‌کدام از پانسمان‌های نقره قادر به ریشه‌کن کردن بیوفیلم نبوده‌اند، که این امر نیاز به یک رویکرد جامع برای درمان عفونت‌های بیوفیلم زخم را تأیید می‌کند؛ استفاده از بازوبندهای نقره. درمان با دبریدمان فیزیکی برای حذف بیشتر بیوفیلم انجام می‌شود.
زخم‌های مزمن اغلب در حالت التهاب شدید هستند و سلول‌های التهابی اضافی برای مدت طولانی در بافت زخم باقی می‌مانند و باعث آسیب بافتی و کاهش اکسیژن مورد نیاز برای متابولیسم و ​​عملکرد سلولی کارآمد در زخم می‌شوند.26 بیوفیلم‌ها با تأثیر منفی بر بهبود زخم از طرق مختلف، از جمله مهار تکثیر و مهاجرت سلولی و فعال‌سازی سیتوکین‌های پیش التهابی، این محیط خصمانه زخم را تشدید می‌کنند.27 با مؤثرتر شدن پانسمان‌های نقره، درک تأثیر آنها بر محیط زخم و بهبود زخم مهم است.
جالب توجه است که اگرچه همه پانسمان‌های نقره بر ترکیب بیوفیلم تأثیر گذاشتند، اما فقط پانسمان‌های نمک نقره اکسیژن‌دار باعث افزایش اپیتلیالیزاسیون مجدد این زخم‌های عفونی شدند. این داده‌ها از یافته‌های قبلی ما17 و یافته‌های کلان و همکاران (2017)28 پشتیبانی می‌کنند که نشان دهنده پروفایل‌های ایمنی و سمیت خوب نمک‌های نقره اکسیژن‌دار بود، زیرا غلظت‌های پایین‌تر نقره در برابر بیوفیلم‌ها مؤثر بودند.
مطالعه فعلی ما تفاوت‌های فناوری نقره بین پانسمان‌های نقره ضدمیکروبی و تأثیر این فناوری بر محیط زخم و بهبود مستقل از عفونت را برجسته می‌کند. با این حال، این نتایج با مطالعات قبلی که نشان می‌داد پانسمان Ag1+ + EDTA/BC پارامترهای بهبودی گوش‌های آسیب‌دیده خرگوش را در داخل بدن بهبود می‌بخشد، متفاوت است. با این حال، این ممکن است به دلیل تفاوت در مدل‌های حیوانی، زمان اندازه‌گیری و روش‌های استفاده از باکتری باشد29. در این مورد، اندازه‌گیری‌های زخم 12 ​​روز پس از آسیب انجام شد تا مواد فعال پانسمان بتوانند در مدت زمان طولانی‌تری روی بیوفیلم عمل کنند. این موضوع توسط مطالعه‌ای پشتیبانی می‌شود که نشان داد زخم‌های پای عفونی بالینی که با Ag1+ + EDTA/BC درمان شده‌اند، در ابتدا پس از یک هفته درمان، و سپس در طول 3 هفته بعدی درمان با Ag1+ + EDTA/BC و ظرف 4 هفته استفاده از داروهای غیر ضدمیکروبی، افزایش اندازه پیدا کردند. پانسمان‌های CMC برای کاهش اندازه زخم‌ها30.
قبلاً نشان داده شده است که اشکال و غلظت‌های خاصی از نقره در شرایط آزمایشگاهی (in vitro) سمیت سلولی دارند11، اما این نتایج آزمایشگاهی همیشه به عوارض جانبی در داخل بدن تبدیل نمی‌شوند. علاوه بر این، پیشرفت در فناوری نقره و درک بهتر ترکیبات و غلظت‌های نقره در پانسمان‌ها منجر به توسعه بسیاری از پانسمان‌های نقره ایمن و مؤثر شده است. با این حال، با پیشرفت فناوری پانسمان نقره، درک تأثیر این پانسمان‌ها بر محیط زخم مهم است31،32،33. قبلاً گزارش شده بود که افزایش سرعت اپیتلیالیزاسیون مجدد با افزایش نسبت ماکروفاژهای ضد التهابی M2 در مقایسه با فنوتیپ پیش التهابی M1 مطابقت دارد. این موضوع در یک مدل موش قبلی مشاهده شد که در آن پانسمان‌های زخم هیدروژل نقره با سولفادیازین نقره و هیدروژل‌های غیر ضد میکروبی مقایسه شدند34.
زخم‌های مزمن ممکن است التهاب بیش از حد نشان دهند و مشاهده شده است که وجود نوتروفیل‌های اضافی ممکن است برای بهبود زخم مضر باشد35. در مطالعه‌ای روی موش‌های فاقد نوتروفیل، وجود نوتروفیل‌ها باعث تأخیر در اپیتلیالیزاسیون مجدد شد. وجود نوتروفیل‌های اضافی منجر به افزایش سطح پروتئازها و گونه‌های فعال اکسیژن، مانند سوپراکسید و پراکسید هیدروژن می‌شود که با زخم‌های مزمن و دیر التیام مرتبط هستند37،38. به همین ترتیب، افزایش تعداد ماکروفاژها، در صورت عدم کنترل، می‌تواند منجر به تأخیر در بهبود زخم شود39. این افزایش به ویژه در صورتی اهمیت دارد که ماکروفاژها قادر به انتقال از فنوتیپ پیش‌التهابی به فنوتیپ پیش‌التیامی نباشند و در نتیجه زخم‌ها نتوانند از فاز التهابی التیام خارج شوند40. ما پس از 3 روز درمان با تمام پانسمان‌های نقره، کاهش نوتروفیل‌ها و ماکروفاژها را در زخم‌های آلوده به بیوفیلم مشاهده کردیم، اما این کاهش با پانسمان‌های نمک اکسیژن‌دار بیشتر بود. این کاهش ممکن است نتیجه مستقیم پاسخ ایمنی به نقره، پاسخ به کاهش بار زیستی یا قرار داشتن زخم در مرحله بعدی بهبودی و در نتیجه کاهش سلول‌های ایمنی در زخم باشد. کاهش تعداد سلول‌های التهابی در زخم ممکن است محیطی را برای بهبود زخم فراهم کند. مکانیسم عمل چگونگی بهبود مستقل از عفونت توسط اکسی‌سالت‌های نقره مشخص نیست، اما توانایی اکسی‌سالت‌های نقره در تولید اکسیژن و از بین بردن سطوح مضر پراکسید هیدروژن، یک واسطه التهاب، ممکن است این موضوع را توضیح دهد و نیاز به مطالعه بیشتر دارد17.
زخم‌های عفونی مزمن و التیام‌ناپذیر، هم برای پزشکان و هم برای بیماران مشکل‌ساز هستند. اگرچه بسیاری از پانسمان‌ها ادعای اثربخشی ضدمیکروبی دارند، اما تحقیقات به ندرت بر سایر عوامل کلیدی مؤثر بر ریزمحیط زخم تمرکز می‌کنند. این مطالعه نشان می‌دهد که فناوری‌های مختلف نقره، مستقل از عفونت، اثربخشی ضدمیکروبی متفاوتی دارند و مهم‌تر از آن، اثرات متفاوتی بر محیط زخم و بهبود آن دارند. اگرچه این مطالعات آزمایشگاهی و درون‌تنی، اثربخشی این پانسمان‌ها را در درمان عفونت‌های زخم و بهبود زخم نشان می‌دهند، اما برای ارزیابی اثربخشی این پانسمان‌ها در کلینیک، به کارآزمایی‌های تصادفی کنترل‌شده نیاز است.
مجموعه داده‌های مورد استفاده و/یا تحلیل‌شده در طول مطالعه‌ی حاضر، بنا به درخواست معقول، از نویسنده‌ی مسئول در دسترس است.