هسته اتولوگ pulposus کاشته شده به استخوان زیر قشر کمری برای ایجاد یک مدل حیوانی از تغییرات مدیک

با تشکر از شما برای بازدید از Nature.com. نسخه مرورگر مورد استفاده شما از CSS محدود است. برای بهترین نتیجه ، توصیه می کنیم از یک مرورگر جدیدتر (یا غیرفعال کردن حالت سازگاری در اینترنت اکسپلورر) استفاده کنید. در ضمن ، برای اطمینان از ادامه پشتیبانی ، سایت را بدون سبک و جاوا اسکریپت نمایش خواهیم داد.
ایجاد مدلهای حیوانی از تغییر مود (MC) مبنای مهمی برای مطالعه MC است. پنجاه و چهار خرگوش سفید نیوزیلند به گروه عمل شمشیرباز ، گروه کاشت عضلات (گروه ME) و گروه کاشت نوکلئوس pulposus (گروه NPE) تقسیم شدند. در گروه NPE ، دیسک بین مهره ای با رویکرد جراحی کمر ارتش در معرض قرار گرفت و از یک سوزن برای سوراخ کردن بدن مهره L5 در نزدیکی صفحه انتهایی استفاده شد. NP از دیسک بین مهره ای L1/2 توسط یک سرنگ استخراج و به آن تزریق شد. حفاری سوراخی در استخوان زیر قشر. روشهای جراحی و روشهای حفاری در گروه کاشت عضلات و گروه عمل شمش همانند گروههای کاشت NP بود. در گروه ME ، تکه ای از عضله در سوراخ قرار گرفت ، در حالی که در گروه گروهی شمشیرباز ، هیچ چیز در سوراخ قرار نگرفت. پس از عمل ، اسکن MRI و آزمایش بیولوژیکی مولکولی انجام شد. سیگنال در گروه NPE تغییر کرد ، اما هیچ تغییر سیگنال آشکار در گروه شمشیرباز و گروه ME مشاهده نشد. مشاهده بافت شناسی نشان داد که تکثیر بافت غیر طبیعی در محل کاشت مشاهده شد ، و بیان IL-4 ، IL-17 و IFN-γ در گروه NPE افزایش یافت. کاشت NP به استخوان زیر قشر می تواند یک مدل حیوانی از MC را تشکیل دهد.
تغییرات معین (MC) ضایعات انتهای مهره و مغز استخوان مجاور است که در تصویربرداری رزونانس مغناطیسی (MRI) قابل مشاهده است. آنها در افراد مبتلا به علائم مرتبط با آنها کاملاً شایع هستند. بسیاری از مطالعات بر اهمیت MC به دلیل ارتباط آن با کمردرد (LBP) 2،3 تأکید کرده اند. De Roos et al.4 و Modic et al.5 به طور مستقل برای اولین بار سه نوع مختلف ناهنجاری سیگنال تحت شکنجه را در مغز استخوان مهره توصیف کردند. تغییرات نوع I Hypointense در توالی T1 وزن (T1W) و Hyperintense در توالی T2 وزن (T2W) است. این ضایعه صفحات شکاف و بافت گرانول عروقی مجاور در مغز استخوان را نشان می دهد. تغییرات Modic Type II سیگنال بالایی را در هر دو توالی T1W و T2W نشان می دهد. در این نوع ضایعه ، تخریب صفحات می توان یافت ، و همچنین جایگزینی چربی بافت شناسی مغز استخوان مجاور است. تغییرات Modic Type III سیگنال کم در توالی T1W و T2W را نشان می دهد. ضایعات اسکلروتیک مربوط به صفحه های انتهایی مشاهده شده است. MC یک بیماری آسیب شناختی ستون فقرات محسوب می شود و از نزدیک با بسیاری از بیماری های دژنراتیو ستون فقرات 7،8،9 همراه است.
با توجه به داده های موجود ، چندین مطالعه بینش مفصلی در مورد علت شناسی و مکانیسم های پاتولوژیک MC ارائه داده اند. آلبرت و همکاران. پیشنهاد کرد که MC ممکن است ناشی از فتق دیسک باشد. هو و همکاران. MC را به تخریب شدید دیسک 10 نسبت داد. KROC مفهوم "پارگی دیسک داخلی" را پیشنهاد کرد ، که بیان می کند که تروما دیسک تکراری ممکن است منجر به ریزگردها در قسمت انتهایی شود. پس از تشکیل شکاف ، تخریب صفحه توسط هسته Pulposus (NP) ممکن است یک پاسخ خود ایمنی را ایجاد کند ، که این امر بیشتر منجر به توسعه MC11 می شود. کارشناسی ارشد و همکاران. دیدگاه مشابهی را به اشتراک گذاشت و گزارش داد که خود ایمنی ناشی از NP نقش مهمی در پاتوژنز MC12 دارد.
سلولهای سیستم ایمنی ، به ویژه لنفوسیتهای یاور CD4+ T ، نقش مهمی در پاتوژنز خود ایمنی خود دارند. زیر مجموعه Th17 که اخیراً کشف شده است ، سیتوکین پیش التهابی IL-17 تولید می کند ، بیان شیموکاین را ترویج می کند و سلولهای T را در اندامهای آسیب دیده تحریک می کند تا IFN-γ14 را تولید کنند. سلولهای Th2 همچنین نقش منحصر به فردی در پاتوژنز پاسخهای ایمنی دارند. بیان IL-4 به عنوان یک سلول نماینده Th2 می تواند منجر به عواقب ایمونوپاتولوژیکی شدید 15 شود.
اگرچه بسیاری از مطالعات بالینی در مورد MC16،17،18،19،20،21،22،23،24 انجام شده است ، اما هنوز کمبود مدل های آزمایشی مناسب حیوانات وجود دارد که می تواند روند MC را که اغلب در انسان اتفاق می افتد تقلید کند و می تواند باشد. برای بررسی علت شناسی یا درمانهای جدید مانند درمان هدفمند استفاده می شود. تا به امروز ، تنها چند مدل حیوانی MC برای مطالعه مکانیسم های پاتولوژیک اساسی گزارش شده است.
بر اساس نظریه خود ایمنی که توسط آلبرت و کارشناسی ارشد ارائه شده است ، این مطالعه یک مدل خرگوش ساده و قابل تکرار MC را با پیوند دادن NP در نزدیکی صفحه انتهای مهره حفر ایجاد کرده است. اهداف دیگر مشاهده خصوصیات بافت شناسی مدلهای حیوانی و ارزیابی مکانیسم های خاص NP در توسعه MC است. برای این منظور ، ما از تکنیک هایی مانند زیست شناسی مولکولی ، MRI و مطالعات بافت شناسی برای مطالعه پیشرفت MC استفاده می کنیم.
دو خرگوش در اثر خونریزی در حین عمل درگذشت و چهار خرگوش در هنگام بیهوشی در هنگام MRI درگذشت. 48 خرگوش باقیمانده زنده مانده و بعد از عمل هیچ نشانه رفتاری یا عصبی نشان ندادند.
MRI نشان می دهد که شدت سیگنال بافت تعبیه شده در سوراخ های مختلف متفاوت است. شدت سیگنال بدنه مهره L5 در گروه NPE به تدریج در 12 ، 16 و 20 هفته پس از درج تغییر یافت (توالی T1W سیگنال کم را نشان داد ، و توالی T2W سیگنال مختلط به همراه سیگنال کم را نشان داد) (شکل 1C) ، در حالی که ظاهر MRI ظاهر می شود. از دو گروه دیگر از قسمت های تعبیه شده در همین مدت نسبتاً پایدار مانده است (شکل 1A ، B).
(الف) MRI های متوالی نماینده ستون فقرات کمر خرگوش در 3 نقطه زمانی. هیچ ناهنجاری سیگنال در تصاویر گروه عمل شمشیرباز یافت نشد. (ب) خصوصیات سیگنال بدنه مهره در گروه ME شبیه به گروه های گروه شمشیر است و هیچ تغییر سیگنال قابل توجهی در محل تعبیه به مرور زمان مشاهده نمی شود. (ج) در گروه NPE ، سیگنال کم در توالی T1W به وضوح قابل مشاهده است ، و سیگنال مختلط و سیگنال کم در دنباله T2W به وضوح قابل مشاهده است. از دوره 12 هفته تا دوره 20 هفته ، سیگنال های پراکنده بالا پیرامون سیگنال های پایین در دنباله T2W کاهش می یابد.
هیپرپلازی استخوانی آشکار را می توان در محل کاشت بدن مهره در گروه NPE مشاهده کرد ، و هیپرپلازی استخوان از 12 تا 20 هفته سریعتر رخ می دهد (شکل 2C) در مقایسه با گروه NPE ، هیچ تغییر قابل توجهی در مهره های مدل مشاهده نمی شود اجساد ؛ گروه شم و گروه من (شکل 2C) 2A ، ب).
(الف) سطح بدن مهره در قسمت کاشته شده بسیار صاف است ، سوراخ به خوبی بهبود می یابد ، و در بدن مهره هیچ هیپلازی وجود ندارد. (ب) شکل سایت کاشته شده در گروه ME شبیه به گروه عملیات شم است و هیچ تغییر آشکاری در ظاهر سایت کاشته شده با گذشت زمان وجود ندارد. ج) هایپرپلازی استخوان در سایت کاشته شده در گروه NPE رخ داده است. هیپرپلازی استخوان به سرعت افزایش یافته و حتی از طریق دیسک بین مهره ای به بدن مهره های مقابل گسترش می یابد.
تجزیه و تحلیل بافت شناسی اطلاعات دقیق تری در مورد تشکیل استخوان ارائه می دهد. شکل 3 عکس های بخش های بعد از عمل رنگ آمیزی شده با H&E را نشان می دهد. در گروه عمل شمشیر ، سلولهای غضروفی به خوبی مرتب شده و هیچ تکثیر سلولی تشخیص داده نشده است (شکل 3A). اوضاع در گروه ME شبیه به گروه گروه شمشیر بود (شکل 3B). با این حال ، در گروه NPE ، تعداد زیادی از سلولهای غضروفی و ​​تکثیر سلولهای مانند NP در محل کاشت مشاهده شد (شکل 3C).
(الف) ترابکولا را می توان در نزدیکی صفحه انتهایی مشاهده کرد ، سلولهای غضروفی به طور مرتب با اندازه و شکل سلول یکنواخت و بدون تکثیر (40 بار) مرتب می شوند. (ب) وضعیت سایت کاشت در گروه ME شبیه به گروه شم است. Trabeculae و chondrocytes مشاهده می شود ، اما هیچ تکثیر آشکاری در محل کاشت (40 بار) وجود ندارد. (ب) مشاهده می شود که سلولهای سلولهای غضروفی و ​​سلولهای مانند NP به طور قابل توجهی تکثیر می شوند و شکل و اندازه سلولهای غضروفی ناهموار است (40 بار).
بیان mRNA ژن interleukin 4 (IL-4) ، mRNA اینترلوکین 17 (IL-17) ، و اینترفرون γ (IFN-γ) در هر دو گروه NPE و ME مشاهده شد. هنگامی که سطح بیان ژنهای هدف مقایسه شد ، بیان ژن IL-4 ، IL-17 و IFN-γ در گروه NPE در مقایسه با گروه ME و گروه عمل شم به طور قابل توجهی افزایش یافت (شکل 4) (P <0.05). در مقایسه با گروه عملیات شم ، سطح بیان IL-4 ، IL-17 و IFN-γ در گروه ME فقط اندکی افزایش یافته و به تغییر آماری نرسید (P> 0.05).
بیان mRNA ژن IL-4 ، IL-17 و IFN-γ در گروه NPE روند قابل توجهی بالاتر از گروه های گروه عمل شم و گروه ME را نشان داد (P <0.05).
در مقابل ، سطح بیان در گروه ME تفاوت معنی داری نشان نداد (P> 0.05).
تجزیه و تحلیل وسترن بلات با استفاده از آنتی بادی های تجاری در برابر IL-4 و IL-17 برای تأیید الگوی بیان mRNA تغییر یافته انجام شد. همانطور که در شکل 5a ، B نشان داده شده است ، در مقایسه با گروه ME و گروه عمل شم ، سطح پروتئین IL-4 و IL-17 در گروه NPE به طور قابل توجهی افزایش یافته است (P <0.05). در مقایسه با گروه عملیات شم ، سطح پروتئین IL-4 و IL-17 در گروه ME نیز نتوانست از نظر آماری به تغییرات معنی داری برسد (05 / 0P>).
(الف) سطح پروتئین IL-4 و IL-17 در گروه NPE به طور قابل توجهی بالاتر از گروه های گروه ME و گروه دارونما بود (P <0.05). (ب) هیستوگرام وسترن بلات.
با توجه به تعداد محدودی از نمونه های انسانی به دست آمده در حین عمل ، مطالعات واضح و دقیق در مورد پاتوژنز MC تا حدودی دشوار است. ما سعی کردیم یک مدل حیوانی از MC را برای مطالعه مکانیسم های پاتولوژیک بالقوه آن ایجاد کنیم. در همان زمان ، از ارزیابی رادیولوژی ، ارزیابی بافت شناسی و ارزیابی بیولوژیکی مولکولی برای پیروی از دوره MC ناشی از اتوگرافت NP استفاده شد. در نتیجه ، مدل کاشت NP منجر به تغییر تدریجی در شدت سیگنال از نقاط زمانی 12 هفته به 20 هفته (سیگنال کم مخلوط در توالی T1W و سیگنال کم در توالی T2W) شد ، که نشان دهنده تغییرات بافتی ، و بافت شناسی و مولکولی است ارزیابی های بیولوژیکی نتایج مطالعه رادیولوژیکی را تأیید کرد.
نتایج این آزمایش نشان می دهد که تغییرات بصری و بافت شناسی در محل نقض بدن مهره در گروه NPE رخ داده است. در همان زمان ، بیان ژنهای IL-4 ، IL-17 و IFN-γ ، و همچنین IL-4 ، IL-17 و IFN-γ مشاهده شد ، نشان می دهد که نقض بافت هسته هسته اتولوگ در مهره ها بدن ممکن است یک سری از تغییرات سیگنال و مورفولوژیکی ایجاد کند. به راحتی می توان فهمید که ویژگی های سیگنال اجسام مهره ای مدل حیوانی (سیگنال کم در توالی T1W ، سیگنال مختلط و سیگنال کم در توالی T2W) بسیار شبیه به سلولهای مهره های انسانی و ویژگی های MRI نیز هستند مشاهدات بافت شناسی و آناتومی ناخالص را تأیید کنید ، یعنی تغییر در سلولهای بدن مهره پیشرونده است. اگرچه پاسخ التهابی ناشی از تروما حاد ممکن است به زودی پس از سوراخ شدن ظاهر شود ، نتایج MRI نشان داد که تغییرات سیگنال به تدریج 12 هفته پس از سوراخ شدن ظاهر می شود و تا 20 هفته بدون هیچ گونه نشانه ای از بهبود یا برگشت تغییرات MRI ادامه می یابد. این نتایج نشان می دهد که NP مهره اتولوگ یک روش قابل اعتماد برای ایجاد MV مترقی در خرگوش است.
این مدل سوراخ نیاز به مهارت ، زمان و تلاش جراحی کافی دارد. در آزمایش های اولیه ، برش یا تحریک بیش از حد ساختارهای رباط پاراورتبرال ممکن است منجر به تشکیل استئوفیت های مهره شود. باید مراقب باشید تا دیسک های مجاور آسیب یا تحریک نکند. از آنجا که برای به دست آوردن نتایج مداوم و قابل تکرار باید عمق نفوذ کنترل شود ، ما با قطع کردن غلاف سوزن 3 میلی متر به صورت دستی یک پلاگین درست کردیم. با استفاده از این پلاگین ، عمق حفاری یکنواخت در بدنه مهره را تضمین می کند. در آزمایش های اولیه ، سه جراح ارتوپدی که در این عملیات درگیر بودند ، سوزن های 16 سنج را آسان تر برای کار با سوزن 18 سنج یا روش های دیگر پیدا کردند. برای جلوگیری از خونریزی بیش از حد در هنگام حفاری ، نگه داشتن سوزن برای مدتی یک سوراخ درج مناسب تر فراهم می کند ، نشان می دهد که درجه خاصی از MC از این طریق قابل کنترل است.
اگرچه بسیاری از مطالعات MC را هدف قرار داده اند ، اما در مورد علت و پاتوژنز MC25،26،27 اطلاعات کمی وجود دارد. بر اساس مطالعات قبلی ما ، دریافتیم که خود ایمنی نقش اساسی در وقوع و توسعه MC12 دارد. این مطالعه بیان کمی از IL-4 ، IL-17 و IFN-γ را که مسیرهای اصلی تمایز سلولهای CD4+ پس از تحریک آنتی ژن هستند ، مورد بررسی قرار داد. در مطالعه ما ، در مقایسه با گروه منفی ، گروه NPE بیان بالاتری از IL-4 ، IL-17 و IFN-γ داشت و سطح پروتئین IL-4 و IL-17 نیز بالاتر بود.
از نظر بالینی ، بیان mRNA IL-17 در سلولهای NP از بیماران مبتلا به فتق دیسک 28 افزایش یافته است. افزایش سطح بیان IL-4 و IFN-γ نیز در یک مدل فتق حاد غیررسمی دیسک در مقایسه با گروه کنترل سالم 29 یافت شد. IL-17 نقش مهمی در التهاب ، آسیب بافتی در بیماری های خود ایمنی دارد و پاسخ ایمنی به IFN-γ31 را تقویت می کند. آسیب بافتی با واسطه IL-17 در موش MRL/LPR 32 و موش های قابل مخرب خودکشی 33 گزارش شده است. IL-4 می تواند بیان سیتوکین های پیش التهابی (مانند IL-1β و TNFα) و فعال سازی ماکروفاژ 34 را مهار کند. گزارش شده است که بیان mRNA IL-4 در گروه NPE در مقایسه با IL-17 و IFN-γ در همان زمان متفاوت است. بیان mRNA از IFN-γ در گروه NPE به طور قابل توجهی بالاتر از گروه های دیگر بود. بنابراین ، تولید IFN-γ ممکن است واسطه پاسخ التهابی ناشی از اتصال NP باشد. مطالعات نشان داده اند که IFN-γ توسط انواع مختلف سلول ، از جمله سلولهای H یاور T نوع فعال ، سلولهای قاتل طبیعی و ماکروفاژها 35،36 تولید می شود و یک سیتوکین مهم التهابی است که باعث ایجاد پاسخ ایمنی می شود.
این مطالعه نشان می دهد که پاسخ خود ایمنی ممکن است در وقوع و توسعه MC نقش داشته باشد. لوما و همکاران. دریافت که ویژگی های سیگنال MC و NP برجسته در MRI مشابه هستند ، و هر دو سیگنال بالایی را در توالی T2W 38 نشان می دهند. برخی از سیتوکین ها تأیید شده اند که از نزدیک با وقوع MC مانند IL-139 در ارتباط هستند. کارشناسی ارشد و همکاران. پیشنهاد کرد که برآمدگی رو به بالا یا رو به پایین NP ممکن است تأثیر زیادی در وقوع و پیشرفت MC12 داشته باشد. Bobechko40 و Herzbein و همکاران 41 گزارش دادند که NP یک بافت ایمنی است که از بدو تولد نمی تواند وارد گردش عروقی شود. برآمدگی های NP اجساد خارجی را وارد خون می کنند و از این طریق واسطه واکنشهای خود ایمنی محلی 42. واکنشهای خود ایمنی می تواند تعداد زیادی از عوامل ایمنی را القا کند و هنگامی که این عوامل به طور مداوم در معرض بافت قرار می گیرند ، می توانند باعث تغییر در سیگنالینگ 43 شوند. در این مطالعه ، بیان بیش از حد IL-4 ، IL-17 و IFN-γ از عوامل ایمنی معمولی هستند و بیشتر رابطه نزدیک بین NP و MCS44 را اثبات می کنند. این مدل حیوانی به خوبی از دستیابی به موفقیت NP و ورود به صفحه انتهایی تقلید می کند. این روند بیشتر تأثیر خود ایمنی بر MC را نشان داد.
همانطور که انتظار می رود ، این مدل حیوانات یک بستر احتمالی برای مطالعه MC در اختیار ما قرار می دهد. با این حال ، این مدل هنوز هم محدودیت هایی دارد: در مرحله اول ، در مرحله مشاهده حیوانات ، برخی از خرگوش های مرحله میانی برای آزمایش زیست شناسی بافت شناسی و مولکولی باید از بین بروند ، بنابراین برخی از حیوانات با گذشت زمان "از بین می روند". ثانیاً ، اگرچه سه نقطه زمانی در این مطالعه تعیین شده است ، متأسفانه ، ما فقط یک نوع MC را مدل کردیم (نوع Modic I تغییر) ، بنابراین نشان دادن فرآیند رشد بیماری انسان کافی نیست ، و باید امتیازات زمانی بیشتری تعیین شود بهتر است همه تغییرات سیگنال را مشاهده کنید. ثالثاً ، تغییرات در ساختار بافت در واقع با رنگ آمیزی بافت شناسی به وضوح نشان داده می شود ، اما برخی از تکنیک های تخصصی می توانند بهتر تغییرات ریزساختاری در این مدل را نشان دهند. به عنوان مثال ، از میکروسکوپ نوری قطبی برای تجزیه و تحلیل تشکیل فیبروکارتیلژ در دیسک های بین مهره ای خرگوش 45 استفاده شد. اثرات طولانی مدت NP بر MC و صفحه نهایی نیاز به مطالعه بیشتر دارد.
پنجاه و چهار خرگوش سفید نیوزیلند (وزن حدود 2.5-3 کیلوگرم ، 3-3.5 ماه) به طور تصادفی به گروه عمل شم ، گروه کاشت عضلات (گروه ME) و گروه کاشت ریشه عصبی (گروه NPE) تقسیم شدند. تمام مراحل آزمایشی توسط کمیته اخلاق بیمارستان تیانجین تصویب شد و روشهای آزمایشی مطابق با دستورالعمل های مصوب انجام شد.
برخی از پیشرفت ها در تکنیک جراحی S. sobajima 46 انجام شده است. هر خرگوش در یک موقعیت جانبی جانبی قرار گرفت و سطح قدامی پنج دیسک بین مهره ای کمر متوالی (IVDS) با استفاده از یک روش رتروپرویتونئال خلفی در معرض دید قرار گرفت. به هر خرگوش بیهوشی عمومی (20 ٪ اورتان ، 5 میلی لیتر در کیلوگرم از طریق ورید) داده شد. برش پوستی طولی از لبه تحتانی دنده ها به لبه لگن ، 2 سانتی متر شکمی به عضلات پاراورتبرال ساخته شده است. ستون فقرات راست راست از L1 تا L6 توسط برش تیز و صاف از بافت زیر جلدی پوشاننده ، بافت رتروپرویتونئال و عضلات در معرض دید قرار گرفت (شکل 6A). سطح دیسک با استفاده از لبه لگن به عنوان یک نقطه عطف آناتومیکی برای سطح دیسک L5-L6 تعیین شد. از یک سوزن سوراخ 16 سنج برای سوراخ کردن سوراخی در نزدیکی صفحه انتهایی مهره L5 به عمق 3 میلی متر استفاده کنید (شکل 6B). از یک سرنگ 5 میلی لیتری برای آسپیراسیون هسته هسته اتولوگ در دیسک بین مهره ای L1-L2 استفاده کنید (شکل 6C). با توجه به الزامات هر گروه ، پالپوس یا عضله هسته را بردارید. پس از عمیق شدن سوراخ مته ، بخیه های قابل جذب بر روی فاشیای عمیق ، فاشیای سطحی و پوست قرار می گیرند و مراقبت می شود که به بافت پریوستئال بدن مهره در حین عمل آسیب نرساند.
(الف) دیسک L5 -L6 از طریق یک رویکرد رتروپرویتونئال خلفی در معرض قرار می گیرد. (ب) از یک سوزن 16 سنج برای حفاری سوراخی در نزدیکی صفحه L5 استفاده کنید. ج) MF های اتولوگ برداشت می شوند.
بیهوشی عمومی با 20 ٪ اورتان (5 میلی لیتر در کیلوگرم) از طریق ورید گوش انجام شد و رادیوگرافی ستون فقرات کمر در 12 ، 16 و 20 هفته بعد از عمل تکرار شد.
خرگوش ها با تزریق عضلانی کتامین (25.0 میلی گرم در کیلوگرم) و پنتوباربیتال سدیم داخل وریدی (1.2 گرم در کیلوگرم) در 12 ، 16 و 20 هفته پس از عمل قربانی شدند. کل ستون فقرات برای تجزیه و تحلیل بافت شناسی برداشته شد و تجزیه و تحلیل واقعی انجام شد. رونویسی معکوس کمی (RT-QPCR) و وسترن بلات برای تشخیص تغییرات در عوامل ایمنی استفاده شد.
معاینات MRI در خرگوش ها با استفاده از یک آهنربای بالینی 3.0 T (GE Medical Systems ، Florence ، SC) مجهز به گیرنده سیم پیچ اندام متعامد انجام شد. خرگوش ها با 20 ٪ اورتان (5 میلی لیتر در کیلوگرم) از طریق ورید گوش بیهوش شدند و سپس با ناحیه کمر با محوریت یک سیم پیچ سطح دایره ای با قطر 5 اینچی (سیستم های پزشکی GE) به صورت خوابیده در داخل آهنربا قرار گرفتند. تصاویر محلی سازنده T2 T2 (TR ، 1445 ms ؛ TE ، 37 ms) برای تعریف محل دیسک کمر از L3-L4 تا L5-L6 به دست آمد. SAGITTAL PLANE T2 برش های دارای وزن با تنظیمات زیر به دست آمد: توالی سریع اسپین اکو با زمان تکرار (TR) 2200 میلی ثانیه و زمان اکو (TE) 70 میلی ثانیه ، ماتریس. میدان بصری 260 و هشت محرک ؛ ضخامت برش 2 میلی متر ، شکاف 0.2 میلی متر بود.
پس از آخرین عکس گرفته شد و آخرین خرگوش کشته شد ، شم ، عضله تعبیه شده و دیسک های NP برای معاینه بافت شناسی برداشته شدند. بافت ها در 10 ٪ فرمالین بافر خنثی به مدت 1 هفته ثابت شدند ، با اسید اتیلن دی آمینتراستیک اسید و پارافین تقسیم شدند. بلوک های بافتی در پارافین تعبیه شده و با استفاده از میکروتوم به بخش های ساژیتال (ضخامت 5 میکرومتر) بریده شدند. بخش ها با هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) رنگ آمیزی شدند.
پس از جمع آوری دیسک های بین مهره ای از خرگوش ها در هر گروه ، RNA کل با استفاده از یک ستون Uniq-10 (شرکت بیوتکنولوژی شانگهای سانگون ، آموزشی ویبولیتین ، چین) طبق دستورالعمل سازنده و سیستم رونویسی معکوس IMMI II (Promega Inc. ، مدیسون ، WI ، ایالات متحده). رونویسی معکوس انجام شد.
RT-QPCR با استفاده از Prism 7300 (Applied Biosystems Inc. ، USA) و SYBR Green Jump Start Taq Readymix (Sigma-Aldrich ، St. Louis ، MO ، USA) طبق دستورالعمل سازنده انجام شد. حجم واکنش PCR 20 میکرولیتر و حاوی 1.5 میکرولیتر از cDNA رقیق شده و 0.2 میکرومتر از هر آغازگر بود. آغازگرها توسط طراح Oligoperfect (Invitrogen ، Valencia ، CA) طراحی شده و توسط شرکت بیوتکنولوژی Nanjing Golden Stewart ، Ltd. (چین) ساخته شده است (جدول 1). از شرایط دوچرخه سواری حرارتی زیر استفاده شد: مرحله فعال سازی اولیه پلیمراز در دمای 94 درجه سانتیگراد به مدت 2 دقیقه ، سپس 40 چرخه 15 ثانیه در هر 94 درجه سانتیگراد برای دناتوراسیون قالب ، آنسازی به مدت 1 دقیقه در دمای 60 درجه سانتیگراد ، پسوند و فلورسانس. اندازه گیری به مدت 1 دقیقه در دمای 72 درجه سانتیگراد انجام شد. همه نمونه ها سه بار تقویت شدند و از مقدار متوسط ​​برای تجزیه و تحلیل RT-QPCR استفاده شد. داده های تقویت با استفاده از FlexStation 3 (دستگاه های مولکولی ، Sunnyvale ، CA ، USA) مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. بیان ژن IL-4 ، IL-17 و IFN-γ به کنترل درون زا (ACTB) نرمال شد. سطح بیان نسبی mRNA ژن هدف با استفاده از روش 2-δδCT محاسبه شد.
پروتئین کل از بافت با استفاده از هموژنیزر بافت در بافر لیز RIPA (حاوی یک کوکتل مهار کننده پروتئاز و فسفاتاز) استخراج شد و سپس در 13،000 دور در دقیقه به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد سانتریفیوژ شد تا بقایای بافت را از بین ببرد. پنجاه میکروگرم پروتئین در هر خط بارگیری شد ، 10 ٪ SDS-PAGE از هم جدا شد و سپس به یک غشای PVDF منتقل شد. مسدود کردن در 5 ٪ شیر خشک بدون چربی در نمکی بافر تریس (TBS) حاوی 0.1 ٪ Tween 20 به مدت 1 ساعت در دمای اتاق انجام شد. این غشای با آنتی بادی اولیه ضد دسورین خرگوش (رقیق 1: 200 ؛ بوستر ، ووهان ، چین) انکوبه شد (رقیق 1: 200 ؛ بیوس ، پکن ، چین) یک شب در 4 درجه سانتیگراد و در روزهای دوم واکنش نشان داد. با آنتی بادی ثانویه (ایمونوگلوبولین ضد خرگوش بز در 1: 40،000 رقت) همراه با پراکسیداز ترب کوهی (Boster ، Wuhan ، چین) به مدت 1 ساعت در دمای اتاق. سیگنال های وسترن بلات با افزایش شیمی درمانی در غشای شیمیایی پس از تابش اشعه ایکس تشخیص داده شد. برای تجزیه و تحلیل متراکم ، بلات با استفاده از نرم افزار BandScan اسکن و اندازه گیری شد و نتایج به عنوان نسبت ایمنی ژن هدف به ایمنی توبولین بیان شد.
محاسبات آماری با استفاده از بسته نرم افزاری SPSS16.0 (SPSS ، ایالات متحده) انجام شد. داده های جمع آوری شده در طول مطالعه به عنوان میانگین انحراف استاندارد (میانگین ± SD) بیان شد و با استفاده از تجزیه و تحلیل اقدامات مکرر یک طرفه (ANOVA) برای تعیین تفاوت بین دو گروه مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. P <0.05 از نظر آماری معنی دار در نظر گرفته شد.
بنابراین ، ایجاد یک مدل حیوانی از MC با کاشت NP های اتولوگ در بدن مهره و انجام مشاهده کلان ، تجزیه و تحلیل MRI ، ارزیابی بافت شناسی و تجزیه و تحلیل بیولوژیکی مولکولی ممکن است به ابزاری مهم برای ارزیابی و درک مکانیسم های MC انسان تبدیل شود و توسعه درمانی جدید مداخلات
نحوه استناد به این مقاله: هان ، C. و همکاران. یک مدل حیوانی از تغییرات تعدیل شده با کاشت هسته اتولوگ pulposus به استخوان زیر قشر ستون فقرات کمر ایجاد شد. علمی Rep. 6 ، 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt ، D. ، Zanetti ، M. ، Hodler ، J. ، and Boos ، N. تصویربرداری رزونانس مغناطیسی ستون فقرات کمر: شیوع فتق دیسک و احتباس ، فشرده سازی ریشه عصبی ، ناهنجاری های صفحه انتهایی و استئوآرتریت مشترک در داوطلبان بدون علامت بشر نرخ رادیولوژی 209 ، 661-666 ، doi: 10.1148/رادیولوژی .209.3.9844656 (1998).
Kjaer ، P. ، Korsholm ، L. ، Bendix ، T. ، Sorensen ، JS و Leboeuf-Eed ، K. Modic تغییرات و ارتباط آنها با یافته های بالینی. مجله ستون فقرات اروپا: انتشار رسمی جامعه ستون فقرات اروپا ، جامعه اروپایی ناهنجاری ستون فقرات و انجمن اروپا برای تحقیقات ستون فقرات دهانه رحم 15 ، 1312-1319 ، doi: 10.1007/S00586-006-0185-X (2006).
Kuisma ، M. ، et al. تغییرات معین در انتهای مهره های کمر: شیوع و ارتباط با کمردرد و سیاتیک در کارگران مرد میانسال. ستون فقرات 32 ، 1116–1122 ، doi: 10.1097/01.Brs.0000261561.12944.ff (2007).
De Roos ، A. ، Kressel ، H. ، Spritzer ، K. ، and Dalinka ، M. MRI از مغز استخوان در نزدیکی صفحه انتهایی در بیماری دژنراتیو ستون فقرات کمر. AJR مجله آمریکایی رادیولوژی 149 ، 531-534 ، doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic ، MT ، Steinberg ، PM ، Ross ، JS ، Masaryk ، TJ و Carter ، Jr DeCenerative Disc Disc: ارزیابی تغییرات مغز مهره با MRI. رادیولوژی 166 ، 193-199 ، doi: 10.1148/رادیولوژی .166.1.3336678 (1988).
Modic ، MT ، Masaryk ، TJ ، Ross ، JS و Carter ، JR تصویربرداری از بیماری دیسک دژنراتیو. رادیولوژی 168 ، 177-186 ، doi: 10.1148/رادیولوژی .168.1.3289089 (1988).
جنسن ، TS ، و همکاران. پیش بینی کننده تغییرات سیگنال صفحه انتهایی Neovertebral (MODIC) در جمعیت عمومی. مجله ستون فقرات اروپا: انتشار رسمی انجمن ستون فقرات اروپا ، جامعه اروپایی ناهنجاری ستون فقرات و جامعه اروپا برای تحقیقات ستون فقرات گردن رحم ، بخش 19 ، 129-135 ، doi: 10.1007/S00586-009-1184-5 (2010).
آلبرت ، HB و Mannisch ، K. Modic پس از فتق دیسک کمر. مجله ستون فقرات اروپا: انتشار رسمی انجمن ستون فقرات اروپا ، جامعه اروپایی ناهنجاری ستون فقرات و جامعه اروپا برای تحقیقات ستون فقرات گردن رحم 16 ، 977-982 ، doi: 10.1007/S00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula ، L. ، Luoma ، K. ، Vehmas ، T. ، Gronblad ، M. ، and Kaapa ، E. نوع Modic تغییرات نوع I می تواند دژنراسیون دیسک تغییر شکل سریع پیشرونده را پیش بینی کند: یک مطالعه آینده نگر 1 ساله. مجله ستون فقرات اروپا 21 ، 1135–1142 ، doi: 10.1007/S00586-012-2147-9 (2012).
Hu ، ZJ ، Zhao ، FD ، FANG ، XQ و FAN ، SW MODIC تغییرات: علل احتمالی و سهم در تخریب دیسک کمری. فرضیه های پزشکی 73 ، 930-932 ، doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok ، پارگی دیسک داخلی HV. مشکلات پرولاپس دیسک بیش از 50 سال. ستون فقرات (Phila PA 1976) 11 ، 650-653 (1986).