هسته اتولوگ پالپوزوس در استخوان ساب غضروفی کمری برای ایجاد مدل حیوانی تغییرات مودیک کاشته شد.

از بازدید شما از Nature.com سپاسگزاریم. نسخه مرورگری که استفاده می کنید پشتیبانی محدودی از CSS دارد. برای بهترین نتایج، توصیه می کنیم از یک مرورگر جدیدتر (یا غیرفعال کردن حالت سازگاری در اینترنت اکسپلورر) استفاده کنید. در ضمن، برای اطمینان از پشتیبانی مستمر، سایت را بدون استایل و جاوا اسکریپت نمایش خواهیم داد.
ایجاد مدل های حیوانی تغییر مدیک (MC) پایه مهمی برای مطالعه MC است. پنجاه و چهار خرگوش سفید نیوزیلندی به گروه عمل شم، گروه کاشت عضلانی (گروه ME) و گروه کاشت هسته پالپوسوس (گروه NPE) تقسیم شدند. در گروه NPE، دیسک بین مهره‌ای با روش جراحی کمری قدامی جانبی در معرض دید قرار گرفت و از یک سوزن برای سوراخ کردن بدنه مهره L5 در نزدیکی صفحه انتهایی استفاده شد. NP از دیسک بین مهره ای L1/2 توسط یک سرنگ استخراج و به آن تزریق شد. سوراخ کردن استخوان ساب غضروفی روش‌های جراحی و روش‌های سوراخ‌کاری در گروه کاشت عضله و گروه عمل شم مانند گروه کاشت NP بود. در گروه ME، تکه‌ای از عضله در سوراخ قرار داده شد، در حالی که در گروه عملیات شم، چیزی داخل سوراخ قرار داده نشد. پس از عمل، اسکن MRI و آزمایش بیولوژیکی مولکولی انجام شد. سیگنال در گروه NPE تغییر کرد، اما هیچ تغییر سیگنال آشکاری در گروه عملیات ساختگی و گروه ME وجود نداشت. مشاهدات بافت شناسی نشان داد که تکثیر غیر طبیعی بافت در محل کاشت مشاهده شد و بیان IL-4، IL-17 و IFN-γ در گروه NPE افزایش یافت. کاشت NP در استخوان ساب غضروفی می تواند مدل حیوانی MC را تشکیل دهد.
تغییرات مدیک (MC) ضایعات صفحات انتهایی مهره ها و مغز استخوان مجاور آن در تصویربرداری تشدید مغناطیسی (MRI) قابل مشاهده است. آنها در افراد با علائم همراه بسیار شایع هستند. بسیاری از مطالعات بر اهمیت MC به دلیل ارتباط آن با کمردرد (LBP) 2،3 تاکید کرده اند. de Roos و همکاران 4 و Modic و همکاران 5 به طور مستقل برای اولین بار سه نوع مختلف از اختلالات سیگنال زیر غضروفی را در مغز استخوان مهره توصیف کردند. تغییرات مودیک نوع I در توالی‌های T1-weighted (T1W) با شدت کم و در توالی‌های T2-weighted (T2W) با شدت بالا هستند. این ضایعه صفحات انتهایی شکاف و بافت گرانولاسیون عروقی مجاور در مغز استخوان را نشان می دهد. تغییرات Modic نوع II سیگنال بالایی را در هر دو دنباله T1W و T2W نشان می دهد. در این نوع ضایعه، تخریب صفحه انتهایی و همچنین جایگزینی چربی بافتی مغز استخوان مجاور دیده می شود. تغییرات مودیک نوع III سیگنال کم را در توالی های T1W و T2W نشان می دهد. ضایعات اسکلروتیک مربوط به صفحات انتهایی مشاهده شده است. MC به عنوان یک بیماری پاتولوژیک ستون فقرات در نظر گرفته می شود و ارتباط نزدیکی با بسیاری از بیماری های دژنراتیو ستون فقرات 7،8،9 دارد.
با توجه به داده‌های موجود، مطالعات متعددی بینش‌های دقیقی را در مورد علت و مکانیسم‌های پاتولوژیک MC ارائه کرده‌اند. آلبرت و همکاران پیشنهاد کرد که MC ممکن است در اثر فتق دیسک ایجاد شود. هو و همکاران MC را به دژنراسیون شدید دیسک نسبت داد. کروک مفهوم "پارگی دیسک داخلی" را پیشنهاد کرد، که بیان می کند که ضربه های مکرر دیسک ممکن است منجر به ریزش در صفحه انتهایی شود. پس از تشکیل شکاف، تخریب صفحه انتهایی توسط هسته پالپوزوس (NP) ممکن است باعث ایجاد یک پاسخ خود ایمنی شود که بیشتر منجر به ایجاد MC11 می شود. ما و همکاران دیدگاه مشابهی را به اشتراک گذاشت و گزارش داد که خودایمنی ناشی از NP نقش کلیدی در پاتوژنز MC12 ایفا می کند.
سلول های سیستم ایمنی، به ویژه لنفوسیت های کمکی CD4+ T، نقش مهمی در پاتوژنز خودایمنی ایفا می کنند. زیرمجموعه Th17 اخیراً کشف شده، سیتوکین IL-17 پیش التهابی را تولید می کند، بیان کموکاین را تقویت می کند و سلول های T را در اندام های آسیب دیده برای تولید IFN-γ14 تحریک می کند. سلول های Th2 همچنین نقش منحصر به فردی در پاتوژنز پاسخ های ایمنی ایفا می کنند. بیان IL-4 به عنوان یک سلول Th2 نماینده می تواند منجر به پیامدهای آسیب شناسی ایمنی شود.
اگرچه مطالعات بالینی زیادی بر روی MC16،17،18،19،20،21،22،23،24 انجام شده است، اما هنوز مدل‌های آزمایشی حیوانی مناسبی وجود ندارد که بتواند فرآیند MC را که اغلب در انسان اتفاق می‌افتد تقلید کند. برای بررسی علت یا درمان های جدید مانند درمان هدفمند استفاده می شود. تا به امروز، تنها چند مدل حیوانی MC برای مطالعه مکانیسم های پاتولوژیک زیربنایی گزارش شده است.
بر اساس تئوری خودایمنی ارائه شده توسط آلبرت و ما، این مطالعه یک مدل MC خرگوش ساده و قابل تکرار را با پیوند NP در نزدیکی صفحه انتهایی مهره‌ای حفر شده ایجاد کرد. اهداف دیگر مشاهده ویژگی‌های بافت‌شناسی مدل‌های حیوانی و ارزیابی مکانیسم‌های خاص NP در ایجاد MC است. برای این منظور از تکنیک هایی مانند بیولوژی مولکولی، MRI و مطالعات بافت شناسی برای مطالعه پیشرفت MC استفاده می کنیم.
دو خرگوش به دلیل خونریزی حین عمل جراحی و چهار خرگوش در هنگام بیهوشی در حین MRI مردند. 48 خرگوش باقی مانده زنده ماندند و پس از جراحی هیچ علائم رفتاری یا عصبی نشان ندادند.
MRI نشان می دهد که شدت سیگنال بافت تعبیه شده در سوراخ های مختلف متفاوت است. شدت سیگنال بدنه مهره L5 در گروه NPE به تدریج در 12، 16 و 20 هفته پس از درج تغییر کرد (توالی T1W سیگنال کم را نشان داد و دنباله T2W سیگنال مختلط به همراه سیگنال کم را نشان داد) (شکل 1C)، در حالی که MRI ظاهر شد. از دو گروه دیگر از قطعات تعبیه شده در طول همان دوره نسبتاً پایدار باقی ماندند (شکل 1A, B).
(الف) MRIهای متوالی نشان دهنده ستون فقرات کمری خرگوش در 3 نقطه زمانی. هیچ اختلال سیگنالی در تصاویر گروه عمل شم یافت نشد. (ب) ویژگی های سیگنال بدن مهره در گروه ME مشابه آنهایی است که در گروه عملیات ساختگی وجود دارد و هیچ تغییر سیگنال قابل توجهی در محل جاسازی در طول زمان مشاهده نمی شود. (C) در گروه NPE، سیگنال کم به وضوح در دنباله T1W قابل مشاهده است، و سیگنال مختلط و سیگنال پایین به وضوح در دنباله T2W قابل مشاهده است. از دوره 12 هفته ای تا دوره 20 هفته ای، سیگنال های پراکنده بالا در اطراف سیگنال های پایین در توالی T2W کاهش می یابد.
هیپرپلازی آشکار استخوان را می توان در محل کاشت بدن مهره در گروه NPE مشاهده کرد، و هیپرپلازی استخوان از 12 تا 20 هفته سریعتر رخ می دهد (شکل 2C) در مقایسه با گروه NPE، هیچ تغییر قابل توجهی در مهره مدل شده مشاهده نشد. بدن ها گروه شم و گروه ME (شکل 2C) 2A,B).
(الف) سطح بدن مهره در قسمت کاشته شده بسیار صاف است، سوراخ به خوبی بهبود می یابد، و هیپرپلازی در بدن مهره وجود ندارد. (ب) شکل محل کاشت در گروه ME مشابه شکل گروه جراحی شم است و در طول زمان تغییر آشکاری در ظاهر محل کاشت دیده نمی شود. (C) هیپرپلازی استخوان در محل کاشته شده در گروه NPE رخ داد. هیپرپلازی استخوان به سرعت افزایش یافت و حتی از طریق دیسک بین مهره ای به بدنه مهره طرف مقابل گسترش یافت.
تجزیه و تحلیل بافت شناسی اطلاعات دقیق تری در مورد تشکیل استخوان ارائه می دهد. شکل 3 عکس های مقاطع بعد از عمل رنگ آمیزی شده با H&E را نشان می دهد. در گروه عمل شم، سلولهای غضروفی به خوبی مرتب شده بودند و هیچ تکثیر سلولی مشاهده نشد (شکل 3A). وضعیت در گروه ME مشابه وضعیت گروه عملیات ساختگی بود (شکل 3B). با این حال، در گروه NPE، تعداد زیادی سلول غضروفی و ​​تکثیر سلول های NP مانند در محل کاشت مشاهده شد (شکل 3C).
(الف) ترابکول ها را می توان در نزدیکی صفحه انتهایی مشاهده کرد، کندروسیت ها به طور منظم با اندازه و شکل سلولی یکنواخت و بدون تکثیر قرار گرفته اند (40 بار). (ب) وضعیت محل کاشت در گروه ME مشابه وضعیت گروه شم است. ترابکول ها و کندروسیت ها را می توان مشاهده کرد، اما هیچ تکثیر آشکاری در محل کاشت وجود ندارد (40 بار). (ب) مشاهده می شود که سلول های غضروفی و ​​NP مانند به طور قابل توجهی تکثیر می شوند و شکل و اندازه کندروسیت ها ناهموار است (40 برابر).
بیان mRNA ژن اینترلوکین 4 (IL-4)، mRNA ژن اینترلوکین 17 (IL-17)، و mRNA ژن اینترفرون γ (IFN-γ) در هر دو گروه NPE و ME مشاهده شد. هنگامی که سطح بیان ژن‌های هدف مقایسه شد، بیان ژن‌های IL-4، IL-17 و IFN-γ در گروه NPE در مقایسه با گروه ME و گروه عملیات شم به طور قابل‌توجهی افزایش یافت (شکل 4). (P <0.05). در مقایسه با گروه عمل شم، سطح بیان IL-4، IL-17 و IFN-γ در گروه ME فقط اندکی افزایش یافت و به تغییر آماری نرسید (05/0 > P).
بیان mRNA IL-4، IL-17 و IFN-γ در گروه NPE روند به طور قابل توجهی بالاتر از گروه عمل شم و گروه ME نشان داد (05/0 > P).
در مقابل، سطح بیان در گروه ME تفاوت معنی داری نشان نداد (05/0P>).
تجزیه و تحلیل وسترن بلات با استفاده از آنتی بادی های تجاری موجود علیه IL-4 و IL-17 برای تایید الگوی بیان mRNA تغییر یافته انجام شد. همانطور که در شکل های 5A،B نشان داده شده است، در مقایسه با گروه ME و گروه عمل شم، سطح پروتئین IL-4 و IL-17 در گروه NPE به طور قابل توجهی افزایش یافته است (P <0.05). در مقایسه با گروه جراحی شم، سطوح پروتئین IL-4 و IL-17 در گروه ME نیز نتوانست به تغییرات آماری معنی‌داری برسد (05/0 P>).
(الف) سطوح پروتئین IL-4 و IL-17 در گروه NPE به طور قابل توجهی بالاتر از سطح پروتئین در گروه ME و گروه دارونما بود (P <0.05). (ب) هیستوگرام وسترن بلات.
با توجه به تعداد محدود نمونه های انسانی به دست آمده در طول جراحی، مطالعات واضح و دقیق در مورد پاتوژنز MC تا حدودی دشوار است. ما سعی کردیم یک مدل حیوانی MC برای مطالعه مکانیسم‌های پاتولوژیک بالقوه آن ایجاد کنیم. در همان زمان، ارزیابی رادیولوژیک، ارزیابی بافت شناسی و ارزیابی بیولوژیکی مولکولی برای پیگیری سیر MC القا شده توسط اتوگرافت NP استفاده شد. در نتیجه، مدل کاشت NP منجر به تغییر تدریجی در شدت سیگنال از نقاط زمانی 12 هفته به 20 هفته شد (سیگنال کم مخلوط در توالی‌های T1W و سیگنال کم در توالی‌های T2W)، که نشان‌دهنده تغییرات بافتی، و بافت‌شناسی و مولکولی است. ارزیابی های بیولوژیکی نتایج مطالعه رادیولوژیکی را تایید کرد.
نتایج این آزمایش نشان می دهد که تغییرات بصری و بافت شناسی در محل آسیب بدن مهره در گروه NPE رخ داده است. در همان زمان، بیان ژن‌های IL-4، IL-17 و IFN-γ و همچنین IL-4، IL-17 و IFN-γ مشاهده شد که نشان‌دهنده نقض بافت پالپوس هسته اتولوگ در مهره‌ها بود. بدن ممکن است باعث ایجاد یک سری تغییرات سیگنالی و مورفولوژیکی شود. به راحتی می توان دریافت که ویژگی های سیگنال بدن مهره های مدل حیوانی (سیگنال کم در توالی T1W، سیگنال مختلط و سیگنال کم در توالی T2W) بسیار شبیه به سلول های مهره انسان است و ویژگی های MRI نیز مشاهدات بافت شناسی و آناتومی ناخالص را تأیید می کند، یعنی تغییرات در سلول های بدن مهره پیش رونده است. اگرچه پاسخ التهابی ناشی از ترومای حاد ممکن است به زودی پس از سوراخ شدن ظاهر شود، نتایج MRI نشان داد که تغییرات سیگنال فزاینده 12 هفته پس از سوراخ شدن ظاهر شد و تا 20 هفته بدون هیچ نشانه ای از بهبود یا معکوس شدن تغییرات MRI ادامه داشت. این نتایج نشان می دهد که NP مهره اتولوگ یک روش قابل اعتماد برای ایجاد MV پیشرونده در خرگوش است.
این مدل سوراخکاری به مهارت کافی، زمان و تلاش جراحی نیاز دارد. در آزمایش‌های اولیه، کالبد شکافی یا تحریک بیش از حد ساختارهای لیگامانی پاراورتبرال ممکن است منجر به تشکیل استئوفیت‌های مهره‌ای شود. باید مراقب بود که دیسک های مجاور آسیب نبیند یا تحریک نشوند. از آنجایی که برای به دست آوردن نتایج ثابت و قابل تکرار باید عمق نفوذ را کنترل کرد، ما به صورت دستی با بریدن غلاف یک سوزن به طول 3 میلی متر یک پلاگین ساختیم. استفاده از این پلاگین عمق حفاری یکنواخت را در بدنه مهره تضمین می کند. در آزمایش‌های اولیه، سه جراح ارتوپد درگیر در این عمل، کار با سوزن‌های گیج 16 را آسان‌تر از سوزن‌های گیج 18 یا روش‌های دیگر یافتند. برای جلوگیری از خونریزی بیش از حد در حین حفاری، ثابت نگه داشتن سوزن برای مدتی باعث ایجاد سوراخ مناسب تری می شود که نشان می دهد درجه خاصی از MC را می توان به این روش کنترل کرد.
اگرچه بسیاری از مطالعات MC را هدف قرار داده اند، اطلاعات کمی در مورد علت و پاتوژنز MC25،26،27 وجود دارد. بر اساس مطالعات قبلی ما، متوجه شدیم که خودایمنی نقش کلیدی در بروز و توسعه MC12 ایفا می کند. این مطالعه بیان کمی IL-4، IL-17 و IFN-γ را که مسیرهای اصلی تمایز سلول های CD4+ پس از تحریک آنتی ژن هستند، مورد بررسی قرار داد. در مطالعه ما، در مقایسه با گروه منفی، گروه NPE بیان بیشتری از IL-4، IL-17 و IFN-γ داشتند و سطح پروتئین IL-4 و IL-17 نیز بالاتر بود.
از نظر بالینی، بیان mRNA IL-17 در سلول های NP بیماران مبتلا به فتق دیسک افزایش می یابد. افزایش سطح بیان IL-4 و IFN-γ نیز در مدل فتق دیسک حاد غیر فشاری در مقایسه با افراد سالم مشاهده شد. IL-17 نقش کلیدی در التهاب، آسیب بافتی در بیماری‌های خودایمنی دارد و پاسخ ایمنی به IFN-γ31 را افزایش می‌دهد. آسیب بافتی با واسطه IL-17 در موشهای MRL/lpr32 و موشهای حساس به خودایمنی33 گزارش شده است. IL-4 می تواند بیان سایتوکاین های پیش التهابی (مانند IL-1β و TNFα) و فعال سازی ماکروفاژها را مهار کند. گزارش شد که بیان mRNA IL-4 در گروه NPE در مقایسه با IL-17 و IFN-γ در همان نقطه زمانی متفاوت بود. بیان mRNA IFN-γ در گروه NPE به طور قابل توجهی بیشتر از سایر گروه ها بود. بنابراین، تولید IFN-γ ممکن است یک واسطه برای پاسخ التهابی ناشی از تداخل NP باشد. مطالعات نشان داده‌اند که IFN-γ توسط انواع سلول‌های متعدد، از جمله سلول‌های کمکی T نوع 1، سلول‌های کشنده طبیعی و ماکروفاژها تولید می‌شود و یک سیتوکین پیش‌التهابی کلیدی است که پاسخ‌های ایمنی را تقویت می‌کند.
این مطالعه نشان می دهد که پاسخ خود ایمنی ممکن است در بروز و توسعه MC دخیل باشد. لوما و همکاران دریافتند که ویژگی‌های سیگنال MC و NP برجسته در MRI مشابه هستند و هر دو سیگنال بالایی را در توالی T2W نشان می‌دهند. برخی از سیتوکین ها ارتباط نزدیکی با وقوع MC تایید شده است، مانند IL-139. ما و همکاران نشان داد که بیرون زدگی به سمت بالا یا پایین NP ممکن است تأثیر زیادی در بروز و توسعه MC12 داشته باشد. Bobechko40 و Herzbein و همکاران 41 گزارش کردند که NP یک بافت مقاوم در برابر ایمنی است که نمی تواند از بدو تولد وارد گردش خون عروقی شود. برآمدگی‌های NP اجسام خارجی را وارد خون می‌کنند و در نتیجه واکنش‌های خودایمنی موضعی را واسطه می‌کنند. واکنش‌های خودایمنی می‌توانند تعداد زیادی از عوامل ایمنی را القا کنند و هنگامی که این عوامل به طور مداوم در معرض بافت‌ها قرار می‌گیرند، می‌توانند باعث تغییر در سیگنال دهی شوند. در این مطالعه، بیان بیش از حد IL-4، IL-17 و IFN-γ عوامل ایمنی معمولی هستند که بیشتر رابطه نزدیک بین NP و MCs44 را ثابت می کند. این مدل حیوانی به خوبی پیشرفت NP و ورود به صفحه انتهایی را تقلید می کند. این فرآیند بیشتر تأثیر خودایمنی را بر MC نشان داد.
همانطور که انتظار می رفت، این مدل حیوانی بستری ممکن برای مطالعه MC در اختیار ما قرار می دهد. با این حال، این مدل هنوز دارای محدودیت‌هایی است: اولاً، در مرحله مشاهده حیوانات، برخی از خرگوش‌های مرحله متوسط ​​باید برای آزمایش‌های بافت‌شناسی و زیست‌شناسی مولکولی کشته شوند، بنابراین برخی از حیوانات به مرور زمان از دسترس خارج می‌شوند. ثانیاً، اگرچه سه نقطه زمانی در این مطالعه تعیین شده است، متأسفانه، ما فقط یک نوع MC (تغییر نوع مودیک I) را مدل‌سازی کردیم، بنابراین برای نشان دادن روند توسعه بیماری انسانی کافی نیست و باید نقاط زمانی بیشتری تعیین کرد. بهتر است تمام تغییرات سیگنال را مشاهده کنید. ثالثاً، تغییرات در ساختار بافت را می‌توان به وضوح با رنگ‌آمیزی بافت‌شناسی نشان داد، اما برخی تکنیک‌های تخصصی می‌توانند تغییرات ریزساختاری را در این مدل بهتر آشکار کنند. به عنوان مثال، میکروسکوپ نور پلاریزه برای تجزیه و تحلیل تشکیل فیبرو غضروف در دیسک های بین مهره ای خرگوش استفاده شد. اثرات طولانی مدت NP بر روی MC و صفحه انتهایی نیاز به مطالعه بیشتر دارد.
پنجاه و چهار خرگوش نر سفید نیوزیلندی (وزن حدود 2.5-3 کیلوگرم، سن 3-3.5 ماه) به طور تصادفی به گروه جراحی شم، گروه کاشت عضلانی (گروه ME) و گروه کاشت ریشه عصبی (گروه NPE) تقسیم شدند. تمام مراحل آزمایشی توسط کمیته اخلاق بیمارستان تیانجین تایید شد و روش های آزمایشی مطابق با دستورالعمل های تایید شده انجام شد.
بهبودهایی در تکنیک جراحی S. Sobajima 46 ایجاد شده است. هر خرگوش در حالت درازکشی جانبی قرار گرفت و سطح قدامی پنج دیسک بین مهره‌ای کمری متوالی (IVDs) با استفاده از روش خلفی صفاقی در معرض دید قرار گرفت. به هر خرگوش بیهوشی عمومی داده شد (اورتان 20 درصد، 5 میلی لیتر بر کیلوگرم از طریق ورید گوش). یک برش طولی پوست از لبه پایینی دنده ها تا لبه لگن، 2 سانتی متر از شکمی تا عضلات پاراورتبرال ایجاد شد. ستون فقرات قدامی جانبی راست از L1 تا L6 با برش تیز و بی‌حرکت بافت زیر جلدی، بافت خلفی صفاقی و ماهیچه‌ها نمایان شد (شکل 6A). سطح دیسک با استفاده از لبه لگن به عنوان نقطه عطف تشریحی برای سطح دیسک L5-L6 تعیین شد. از یک سوزن سوراخ گیج 16 برای سوراخ کردن نزدیک صفحه انتهایی مهره L5 تا عمق 3 میلی متر استفاده کنید (شکل 6B). از یک سرنگ 5 میلی لیتری برای آسپیره کردن هسته اتولوگ پالپوس در دیسک بین مهره ای L1-L2 استفاده کنید (شکل 6C). بر اساس نیاز هر گروه، هسته پالپوس یا عضله را بردارید. پس از عمیق شدن سوراخ مته، بخیه های قابل جذب روی فاسیای عمقی، فاسیای سطحی و پوست قرار می گیرد و مراقب است که در حین جراحی به بافت پریوستال بدن مهره آسیب نرسد.
(الف) دیسک L5-L6 از طریق یک رویکرد خلفی صفاقی خلفی در معرض قرار می گیرد. (ب) از یک سوزن گیج 16 برای سوراخ کردن نزدیک صفحه انتهایی L5 استفاده کنید. (C) MF های اتولوگ برداشت می شوند.
بیهوشی عمومی با اورتان 20 درصد (5 میلی لیتر بر کیلوگرم) از طریق ورید گوش انجام شد و رادیوگرافی ستون فقرات کمری در هفته های 12، 16 و 20 بعد از عمل تکرار شد.
خرگوش ها با تزریق عضلانی کتامین (25.0 میلی گرم بر کیلوگرم) و سدیم پنتوباربیتال (1.2 گرم بر کیلوگرم) در هفته های 12، 16 و 20 پس از جراحی قربانی شدند. کل ستون فقرات برای تجزیه و تحلیل بافت شناسی برداشته شد و تجزیه و تحلیل واقعی انجام شد. رونویسی معکوس کمی (RT-qPCR) و وسترن بلات برای تشخیص تغییرات در فاکتورهای ایمنی استفاده شد.
معاینات MRI در خرگوش ها با استفاده از یک آهنربای بالینی 3.0 T (GE Medical Systems، Florence، SC) مجهز به گیرنده سیم پیچ اندام متعامد انجام شد. خرگوش‌ها با اورتان 20 درصد (5 میلی‌لیتر بر کیلوگرم) از طریق ورید گوش بیهوش شدند و سپس به پشت در داخل آهنربا با ناحیه کمر در مرکز یک سیم پیچ سطح دایره‌ای به قطر 5 اینچ (GE Medical Systems) قرار گرفتند. تصاویر محلی‌ساز با وزن T2 (TR، 1445 میلی‌ثانیه؛ TE، 37 میلی‌ثانیه) برای تعیین محل دیسک کمر از L3-L4 تا L5-L6 به دست آمد. برش های وزن T2 صفحه ساژیتال با تنظیمات زیر به دست آمدند: دنباله اسپین-اکوی سریع با زمان تکرار (TR) 2200 میلی ثانیه و زمان اکو (TE) 70 میلی ثانیه، ماتریس. میدان بینایی 260 و هشت محرک. ضخامت برش 2 میلی متر، شکاف 0.2 میلی متر بود.
پس از گرفتن آخرین عکس و کشته شدن آخرین خرگوش، دیسک های ساختگی، عضلانی و NP برای بررسی بافت شناسی برداشته شد. بافت ها به مدت 1 هفته در فرمالین بافر خنثی 10 درصد تثبیت شدند، با اتیلن دی آمین تتراستیک اسید کلسیم زدایی و پارافین برش داده شدند. بلوک های بافت در پارافین جاسازی شده و با استفاده از میکروتوم به بخش های ساژیتال (ضخامت 5 میکرومتر) بریده شدند. برش ها با هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) رنگ آمیزی شدند.
پس از جمع‌آوری دیسک‌های بین مهره‌ای از خرگوش‌های هر گروه، RNA کل با استفاده از ستون UNIQ-10 (شانگهای Sangon Biotechnology Co., Ltd., China) طبق دستورالعمل سازنده و یک سیستم رونویسی معکوس Improm II (Promega Inc.) استخراج شد. ، مدیسون، WI، ایالات متحده آمریکا). رونویسی معکوس انجام شد.
RT-qPCR با استفاده از Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., USA) و SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) طبق دستورالعمل سازنده انجام شد. حجم واکنش PCR 20 میکرولیتر بود و حاوی 1.5 میکرولیتر cDNA رقیق شده و 0.2 میکرومولار از هر پرایمر بود. پرایمرها توسط OligoPerfect Designer (Invitrogen، Valencia، CA) طراحی و توسط Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (چین) تولید شدند (جدول 1). شرایط چرخه حرارتی زیر مورد استفاده قرار گرفت: مرحله اولیه فعال‌سازی پلیمراز در دمای 94 درجه سانتی‌گراد به مدت 2 دقیقه، سپس 40 چرخه 15 ثانیه‌ای هر کدام در دمای 94 درجه سانتی‌گراد برای دناتوراسیون الگو، بازپخت به مدت 1 دقیقه در دمای 60 درجه سانتی‌گراد، گسترش و فلورسانس. اندازه گیری ها به مدت 1 دقیقه در دمای 72 درجه سانتی گراد انجام شد. تمام نمونه ها سه بار تکثیر شدند و مقدار متوسط ​​برای آنالیز RT-qPCR استفاده شد. داده های تقویت با استفاده از FlexStation 3 (دستگاه های مولکولی، Sunnyvale، CA، USA) تجزیه و تحلیل شد. بیان ژن IL-4، IL-17 و IFN-γ به کنترل درون زا (ACTB) نرمال شد. سطوح بیان نسبی mRNA هدف با استفاده از روش 2-ΔΔCT محاسبه شد.
پروتئین کل با استفاده از هموژنایزر بافت در بافر لیز RIPA (حاوی کوکتل بازدارنده پروتئاز و فسفاتاز) از بافت ها استخراج شد و سپس با سرعت 13000 دور در دقیقه به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شد تا بقایای بافت حذف شود. 50 میکروگرم پروتئین در هر خط بارگذاری شد، با 10% SDS-PAGE جدا شد و سپس به یک غشاء PVDF منتقل شد. بلوک کردن در شیر خشک بدون چربی 5 درصد در سالین تریس بافر (TBS) حاوی 0.1 درصد توئین 20 به مدت 1 ساعت در دمای اتاق انجام شد. غشاء با آنتی بادی اولیه ضد دکورین خرگوش (رقیق شده 1:200؛ بوستر، ووهان، چین) (رقیق شده 1:200؛ Bioss، پکن، چین) یک شبه در دمای 4 درجه سانتیگراد انکوبه شد و در روزهای دوم واکنش نشان داد. با آنتی بادی ثانویه (ایمونوگلوبولین G ضد خرگوش بز در رقت 1:40000) همراه با پراکسیداز ترب کوهی (بوستر، ووهان، چین) به مدت 1 ساعت در دمای اتاق. سیگنال‌های وسترن بلات با افزایش نورتابی شیمیایی بر روی غشای نورتابی شیمیایی پس از تابش اشعه ایکس شناسایی شدند. برای تجزیه و تحلیل تراکم سنجی، بلات ها با استفاده از نرم افزار BandScan اسکن و کمی سازی شدند و نتایج به عنوان نسبت رنگپذیری ژن هدف به رنگپذیری توبولین بیان شد.
محاسبات آماری با استفاده از بسته نرم افزاری SPSS16.0 (SPSS، ایالات متحده آمریکا) انجام شد. داده های جمع آوری شده در طول مطالعه به صورت میانگین ± انحراف معیار (میانگین ± انحراف معیار) بیان شد و با استفاده از آنالیز واریانس اندازه گیری های مکرر یک طرفه (ANOVA) برای تعیین تفاوت بین دو گروه مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. P <0.05 از نظر آماری معنی دار در نظر گرفته شد.
بنابراین، ایجاد یک مدل حیوانی MC با کاشت NP های اتولوگ در بدن مهره ها و انجام مشاهدات ماکرو آناتومیک، تجزیه و تحلیل MRI، ارزیابی بافت شناسی و تجزیه و تحلیل بیولوژیکی مولکولی ممکن است به ابزار مهمی برای ارزیابی و درک مکانیسم های MC انسان و توسعه روش های درمانی جدید تبدیل شود. مداخلات
نحوه استناد به این مقاله: Han, C. et al. یک مدل حیوانی از تغییرات Modic با کاشت هسته پالپوس اتولوگ در استخوان ساب غضروفی ستون فقرات کمری ایجاد شد. علمی Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
Weishaupt، D.، Zanetti، M.، Hodler، J.، و Boos، N. تصویربرداری رزونانس مغناطیسی از ستون فقرات کمری: شیوع فتق و احتباس دیسک، فشرده سازی ریشه عصبی، ناهنجاری های صفحه انتهایی، و آرتروز مفصل فاست در داوطلبان بدون علامت . نرخ Radiology 209, 661-666, doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
Kjaer, P., Korsholm, L., Bendix, T., Sorensen, JS, and Leboeuf-Eed, K. Modic تغییرات و ارتباط آنها با یافته های بالینی. مجله اروپایی ستون فقرات: انتشار رسمی انجمن اروپایی ستون فقرات، انجمن اروپایی ناهنجاری ستون فقرات، و انجمن اروپایی تحقیقات ستون فقرات گردنی 15، 1312-1319، doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
کویسما، ام.، و همکاران. تغییرات مودیک در صفحات انتهایی مهره های کمری: شیوع و ارتباط با کمردرد و سیاتیک در کارگران مرد میانسال. Spine 32, 1116–1122, doi:10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
de Roos, A., Kressel, H., Spritzer, K., and Dalinka, M. MRI تغییرات مغز استخوان نزدیک صفحه انتهایی در بیماری دژنراتیو ستون فقرات کمری. AJR. مجله آمریکایی رادیولوژی 149، 531-534، doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
Modic، MT، Steinberg، PM، Ross، JS، Masaryk، TJ، و Carter، JR بیماری دیسک دژنراتیو: ارزیابی تغییرات مغز مهره با MRI. Radiology 166, 193-199, doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
تصویربرداری از بیماری دژنراتیو دیسک Modic، MT، Masaryk، TJ، Ross، JS و Carter، JR. رادیولوژی 168، 177-186، doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
جنسن، TS، و همکاران. پیش بینی کننده تغییرات سیگنال صفحه انتهایی نوورتبرال (Modic) در جمعیت عمومی. مجله اروپایی ستون فقرات: انتشار رسمی انجمن اروپایی ستون فقرات، انجمن اروپایی ناهنجاری ستون فقرات، و انجمن اروپایی تحقیقات ستون فقرات گردنی، بخش 19، 129-135، doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
تغییرات Albert, HB and Mannisch, K. Modic پس از فتق دیسک کمر. مجله اروپایی ستون فقرات: انتشار رسمی انجمن ستون فقرات اروپا، انجمن اروپایی ناهنجاری ستون فقرات و انجمن اروپایی تحقیقات ستون فقرات گردنی 16، 977-982، doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula، L.، Luoma، K.، Vehmas، T.، Gronblad، M.، و Kaapa، E. Modic تغییرات نوع I می تواند انحطاط دیسک تغییر شکل پیشرونده سریع را پیش بینی کند: یک مطالعه آینده نگر 1 ساله. مجله ستون فقرات اروپا 21، 1135-1142، doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
تغییرات Hu، ZJ، Zhao، FD، Fang، XQ و Fan، SW Modic: علل احتمالی و کمک به انحطاط دیسک کمر. فرضیه های پزشکی 73، 930-932، doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
Krok، HV پارگی دیسک داخلی. مشکلات افتادگی دیسک بیش از 50 سال ستون فقرات (Phila Pa 1976) 11, 650-653 (1986).