کاشت هسته پالپوزوس اتولوگ در استخوان زیر غضروفی کمری برای ایجاد مدل حیوانی تغییرات مودیک

از بازدید شما از Nature.com متشکریم. نسخه مرورگری که استفاده می‌کنید پشتیبانی محدودی از CSS دارد. برای بهترین نتیجه، توصیه می‌کنیم از یک مرورگر جدیدتر استفاده کنید (یا حالت سازگاری را در Internet Explorer غیرفعال کنید). در عین حال، برای اطمینان از ادامه پشتیبانی، سایت را بدون استایل‌ها و جاوا اسکریپت نمایش خواهیم داد.
ایجاد مدل‌های حیوانی تغییر مودیک (MC) مبنای مهمی برای مطالعه MC است. پنجاه و چهار خرگوش سفید نیوزیلندی به گروه جراحی ساختگی، گروه کاشت عضله (گروه ME) و گروه کاشت هسته پالپوزوس (گروه NPE) تقسیم شدند. در گروه NPE، دیسک بین مهره‌ای با رویکرد جراحی کمری قدامی-جانبی در معرض دید قرار گرفت و از یک سوزن برای سوراخ کردن جسم مهره L5 در نزدیکی صفحه انتهایی استفاده شد. NP توسط یک سرنگ از دیسک بین مهره‌ای L1/2 استخراج و به داخل آن تزریق شد. ایجاد سوراخ در استخوان زیر غضروفی. مراحل جراحی و روش‌های سوراخ کردن در گروه کاشت عضله و گروه جراحی ساختگی مشابه گروه کاشت NP بود. در گروه ME، یک قطعه عضله در سوراخ قرار داده شد، در حالی که در گروه جراحی ساختگی، هیچ چیزی در سوراخ قرار داده نشد. پس از عمل، اسکن MRI و آزمایش بیولوژیکی مولکولی انجام شد. سیگنال در گروه NPE تغییر کرد، اما هیچ تغییر سیگنال واضحی در گروه جراحی ساختگی و گروه ME مشاهده نشد. مشاهدات بافت‌شناسی نشان داد که تکثیر غیرطبیعی بافت در محل کاشت مشاهده شد و بیان IL-4، IL-17 و IFN-γ در گروه NPE افزایش یافت. کاشت NP در استخوان زیر غضروفی می‌تواند یک مدل حیوانی از MC ایجاد کند.
تغییرات مودیک (MC) ضایعاتی در صفحات انتهایی مهره‌ها و مغز استخوان مجاور هستند که در تصویربرداری رزونانس مغناطیسی (MRI) قابل مشاهده هستند. این تغییرات در افراد دارای علائم مرتبط کاملاً رایج هستند.1 بسیاری از مطالعات بر اهمیت MC به دلیل ارتباط آن با کمردرد (LBP) تأکید کرده‌اند.2،3. دِ روس و همکاران.4 و مودیک و همکاران.5 به طور مستقل برای اولین بار سه نوع مختلف از ناهنجاری‌های سیگنال زیرغضروفی را در مغز استخوان مهره‌ها توصیف کردند. تغییرات مودیک نوع I در توالی‌های T1-weighted (T1W) هیپواینتنس و در توالی‌های T2-weighted (T2W) هیپراینتنس هستند. این ضایعه، صفحات انتهایی شکاف‌دار و بافت گرانولاسیون عروقی مجاور را در مغز استخوان نشان می‌دهد. تغییرات مودیک نوع II سیگنال بالایی را در هر دو توالی T1W و T2W نشان می‌دهند. در این نوع ضایعه، تخریب صفحه انتهایی و همچنین جایگزینی چربی بافتی مغز استخوان مجاور را می‌توان یافت. تغییرات مودیک نوع III سیگنال پایینی را در توالی‌های T1W و T2W نشان می‌دهند. ضایعات اسکلروتیک مربوط به صفحات انتهایی مشاهده شده است.6 MC یک بیماری پاتولوژیک ستون فقرات محسوب می‌شود و ارتباط نزدیکی با بسیاری از بیماری‌های دژنراتیو ستون فقرات دارد.7،8،9
با توجه به داده‌های موجود، مطالعات متعددی بینش‌های دقیقی در مورد علت‌شناسی و مکانیسم‌های پاتولوژیک MC ارائه داده‌اند. آلبرت و همکارانش اظهار داشتند که MC ممکن است در اثر فتق دیسک ایجاد شود. هو و همکارانش MC را به دژنراسیون شدید دیسک نسبت دادند. کروک مفهوم "پارگی داخلی دیسک" را مطرح کرد که بیان می‌کند ترومای مکرر دیسک ممکن است منجر به پارگی‌های ریز در صفحه انتهایی شود. پس از تشکیل شکاف، تخریب صفحه انتهایی توسط هسته پالپوزوس (NP) ممکن است یک پاسخ خودایمنی را تحریک کند که در ادامه منجر به ایجاد MC11 می‌شود. ما و همکارانش نیز دیدگاه مشابهی داشتند و گزارش دادند که خودایمنی ناشی از NP نقش کلیدی در پاتوژنز MC12 دارد.
سلول‌های سیستم ایمنی، به ویژه لنفوسیت‌های کمکی CD4+ T، نقش مهمی در پاتوژنز خودایمنی ایفا می‌کنند13. زیرمجموعه Th17 که اخیراً کشف شده است، سیتوکین پیش التهابی IL-17 را تولید می‌کند، بیان کموکاین را افزایش می‌دهد و سلول‌های T را در اندام‌های آسیب‌دیده برای تولید IFN-γ14 تحریک می‌کند. سلول‌های Th2 همچنین نقش منحصر به فردی در پاتوژنز پاسخ‌های ایمنی ایفا می‌کنند. بیان IL-4 به عنوان یک سلول Th2 نماینده می‌تواند منجر به عواقب شدید ایمونوپاتولوژیک شود15.
اگرچه مطالعات بالینی زیادی روی MC16،17،18،19،20،21،22،23،24 انجام شده است، اما هنوز مدل‌های آزمایشگاهی حیوانی مناسبی وجود ندارد که بتوانند فرآیند MC را که اغلب در انسان رخ می‌دهد، تقلید کنند و بتوان از آنها برای بررسی علت یا درمان‌های جدید مانند درمان هدفمند استفاده کرد. تا به امروز، تنها چند مدل حیوانی MC برای مطالعه مکانیسم‌های پاتولوژیک زمینه‌ای گزارش شده است.
بر اساس نظریه خودایمنی ارائه شده توسط آلبرت و ما، این مطالعه یک مدل ساده و تکرارپذیر از بیماری خودایمنی خرگوش (MC) را با پیوند خود به خودی NP در نزدیکی صفحه انتهایی مهره‌ای سوراخ شده ایجاد کرد. اهداف دیگر، مشاهده ویژگی‌های بافت‌شناسی مدل‌های حیوانی و ارزیابی مکانیسم‌های خاص NP در توسعه MC است. برای این منظور، ما از تکنیک‌هایی مانند زیست‌شناسی مولکولی، MRI و مطالعات بافت‌شناسی برای مطالعه پیشرفت MC استفاده می‌کنیم.
دو خرگوش در حین عمل جراحی بر اثر خونریزی و چهار خرگوش در حین بیهوشی هنگام MRI جان خود را از دست دادند. ۴۸ خرگوش باقی مانده زنده ماندند و پس از عمل جراحی هیچ علامت رفتاری یا عصبی نشان ندادند.
MRI نشان می‌دهد که شدت سیگنال بافت فرورفته در سوراخ‌های مختلف متفاوت است. شدت سیگنال جسم مهره L5 در گروه NPE به تدریج در هفته‌های 12، 16 و 20 پس از قرار دادن تغییر کرد (توالی T1W سیگنال کم و توالی T2W سیگنال مختلط به علاوه سیگنال کم را نشان داد) (شکل 1C)، در حالی که ظاهر MRI دو گروه دیگر از قطعات فرورفته در همان دوره نسبتاً پایدار ماند (شکل 1A، B).
(الف) MRI های متوالی نماینده از ستون فقرات کمری خرگوش در 3 نقطه زمانی. هیچ ناهنجاری سیگنالی در تصاویر گروه جراحی ساختگی یافت نشد. (ب) ویژگی های سیگنال جسم مهره در گروه ME مشابه گروه جراحی ساختگی است و هیچ تغییر سیگنال قابل توجهی در محل تعبیه در طول زمان مشاهده نمی شود. (ج) در گروه NPE، سیگنال پایین در توالی T1W به وضوح قابل مشاهده است و سیگنال مختلط و سیگنال پایین در توالی T2W به وضوح قابل مشاهده هستند. از دوره 12 هفته ای تا دوره 20 هفته ای، سیگنال های بالای پراکنده اطراف سیگنال های پایین در توالی T2W کاهش می یابند.
هیپرپلازی استخوان واضحی در محل کاشت جسم مهره در گروه NPE دیده می‌شود و هیپرپلازی استخوان از هفته ۱۲ تا ۲۰ سریع‌تر رخ می‌دهد (شکل ۲C) در مقایسه با گروه NPE، هیچ تغییر قابل توجهی در جسم مهره‌های مدل‌سازی شده مشاهده نمی‌شود؛ گروه Sham و گروه ME (شکل ۲C) ۲A، B).
(الف) سطح جسم مهره در قسمت کاشته شده بسیار صاف است، سوراخ به خوبی بهبود می‌یابد و هیچ هیپرپلازی در جسم مهره وجود ندارد. (ب) شکل محل کاشته شده در گروه ME مشابه گروه جراحی ساختگی است و هیچ تغییر آشکاری در ظاهر محل کاشته شده با گذشت زمان مشاهده نمی‌شود. (ج) هیپرپلازی استخوان در محل کاشته شده در گروه NPE رخ داد. هیپرپلازی استخوان به سرعت افزایش یافت و حتی از طریق دیسک بین مهره‌ای به جسم مهره مقابل نیز گسترش یافت.
تجزیه و تحلیل بافت‌شناسی اطلاعات دقیق‌تری در مورد تشکیل استخوان ارائه می‌دهد. شکل 3 عکس‌های مقاطع پس از عمل رنگ‌آمیزی شده با H&E را نشان می‌دهد. در گروه جراحی ساختگی، کندروسیت‌ها به خوبی مرتب شده بودند و هیچ تکثیر سلولی مشاهده نشد (شکل 3A). وضعیت در گروه ME مشابه گروه جراحی ساختگی بود (شکل 3B). با این حال، در گروه NPE، تعداد زیادی کندروسیت و تکثیر سلول‌های شبه NP در محل کاشت مشاهده شد (شکل 3C).
(الف) ترابکول‌ها در نزدیکی صفحه انتهایی دیده می‌شوند، کندروسیت‌ها به طور مرتب با اندازه و شکل سلولی یکنواخت و بدون تکثیر (40 بار) چیده شده‌اند. (ب) وضعیت محل کاشت در گروه ME مشابه گروه شم است. ترابکول‌ها و کندروسیت‌ها دیده می‌شوند، اما هیچ تکثیر واضحی در محل کاشت وجود ندارد (40 بار). (ب) مشاهده می‌شود که کندروسیت‌ها و سلول‌های شبه NP به طور قابل توجهی تکثیر می‌شوند و شکل و اندازه کندروسیت‌ها ناهموار است (40 بار).
بیان mRNAی اینترلوکین ۴ (IL-4)، mRNAی اینترلوکین ۱۷ (IL-17) و mRNAی اینترفرون گاما (IFN-γ) در هر دو گروه NPE و ME مشاهده شد. هنگامی که سطح بیان ژن‌های هدف مقایسه شد، بیان ژن‌های IL-4، IL-17 و IFN-γ در گروه NPE در مقایسه با گروه ME و گروه جراحی شم به طور قابل توجهی افزایش یافت (شکل ۴) (P < 0.05). در مقایسه با گروه جراحی شم، سطح بیان IL-4، IL-17 و IFN-γ در گروه ME تنها اندکی افزایش یافت و به تغییر آماری نرسید (P > 0.05).
بیان mRNA مربوط به IL-4، IL-17 و IFN-γ در گروه NPE روند معنی‌داری بالاتر از گروه جراحی شم و گروه ME نشان داد (P < 0.05).
در مقابل، سطوح بیان در گروه ME تفاوت معنی‌داری نشان نداد (P>0.05).
آنالیز وسترن بلات با استفاده از آنتی‌بادی‌های موجود در بازار علیه IL-4 و IL-17 برای تأیید الگوی بیان mRNA تغییر یافته انجام شد. همانطور که در شکل‌های 5A و B نشان داده شده است، در مقایسه با گروه ME و گروه عمل جراحی ساختگی، سطح پروتئین IL-4 و IL-17 در گروه NPE به طور قابل توجهی افزایش یافته بود (P < 0.05). در مقایسه با گروه عمل جراحی ساختگی، سطح پروتئین IL-4 و IL-17 در گروه ME نیز به تغییرات آماری معنی‌داری نرسید (P> 0.05).
(الف) سطح پروتئین‌های IL-4 و IL-17 در گروه NPE به طور قابل توجهی بالاتر از گروه ME و گروه دارونما بود (P < 0.05). (ب) هیستوگرام وسترن بلات.
با توجه به تعداد محدود نمونه‌های انسانی به‌دست‌آمده در طول جراحی، مطالعات واضح و دقیق در مورد پاتوژنز MC تا حدودی دشوار است. ما تلاش کردیم تا یک مدل حیوانی از MC ایجاد کنیم تا مکانیسم‌های پاتولوژیک بالقوه آن را مطالعه کنیم. در عین حال، از ارزیابی رادیولوژیکی، ارزیابی بافت‌شناسی و ارزیابی بیولوژیکی مولکولی برای پیگیری سیر MC ناشی از اتوگرافت NP استفاده شد. در نتیجه، مدل کاشت NP منجر به تغییر تدریجی شدت سیگنال از نقاط زمانی 12 هفته تا 20 هفته (سیگنال کم مختلط در توالی‌های T1W و سیگنال کم در توالی‌های T2W) شد که نشان‌دهنده تغییرات بافتی است و ارزیابی‌های بافت‌شناسی و بیولوژیکی مولکولی نتایج مطالعه رادیولوژیکی را تأیید کردند.
نتایج این آزمایش نشان می‌دهد که تغییرات بصری و بافت‌شناسی در محل آسیب جسم مهره در گروه NPE رخ داده است. همزمان، بیان ژن‌های IL-4، IL-17 و IFN-γ و همچنین IL-4، IL-17 و IFN-γ مشاهده شد که نشان می‌دهد آسیب به بافت اتولوگ نوکلئوس پالپوزوس در جسم مهره ممکن است باعث ایجاد یک سری تغییرات سیگنال و مورفولوژیکی شود. به راحتی می‌توان دریافت که ویژگی‌های سیگنال جسم مهره‌های مدل حیوانی (سیگنال پایین در توالی T1W، سیگنال مختلط و سیگنال پایین در توالی T2W) بسیار شبیه به سلول‌های مهره انسان است و ویژگی‌های MRI نیز مشاهدات بافت‌شناسی و آناتومی ناخالص را تأیید می‌کند، یعنی تغییرات در سلول‌های جسم مهره پیشرونده هستند. اگرچه پاسخ التهابی ناشی از ترومای حاد ممکن است کمی پس از سوراخ شدن ظاهر شود، نتایج MRI نشان داد که تغییرات سیگنال به تدریج افزایش یابنده، ۱۲ هفته پس از سوراخ شدن ظاهر شده و تا ۲۰ هفته بدون هیچ نشانه‌ای از بهبودی یا معکوس شدن تغییرات MRI ادامه داشت. این نتایج نشان می‌دهد که NP مهره‌ای اتولوگ یک روش قابل اعتماد برای ایجاد MV پیشرونده در خرگوش‌ها است.
این مدل سوراخ‌کاری نیاز به مهارت، زمان و تلاش جراحی کافی دارد. در آزمایش‌های اولیه، تشریح یا تحریک بیش از حد ساختارهای رباطی پاراورتبرال ممکن است منجر به تشکیل استئوفیت‌های مهره‌ای شود. باید مراقب بود که به دیسک‌های مجاور آسیبی وارد نشود یا آنها را تحریک نکند. از آنجایی که برای دستیابی به نتایج ثابت و تکرارپذیر، عمق نفوذ باید کنترل شود، ما با بریدن غلاف یک سوزن ۳ میلی‌متری، به صورت دستی یک درپوش ایجاد کردیم. استفاده از این درپوش، عمق یکنواخت سوراخ‌کاری در جسم مهره را تضمین می‌کند. در آزمایش‌های اولیه، سه جراح ارتوپد درگیر در این عمل، دریافتند که کار با سوزن‌های ۱۶ گیج نسبت به سوزن‌های ۱۸ گیج یا سایر روش‌ها آسان‌تر است. برای جلوگیری از خونریزی بیش از حد در حین سوراخ‌کاری، ثابت نگه داشتن سوزن برای مدتی، سوراخ مناسب‌تری برای ورود فراهم می‌کند، که نشان می‌دهد می‌توان درجه خاصی از MC را از این طریق کنترل کرد.
اگرچه مطالعات زیادی MC را هدف قرار داده‌اند، اما اطلاعات کمی در مورد علت و پاتوژنز MC25،26،27 وجود دارد. بر اساس مطالعات قبلی ما، دریافتیم که خودایمنی نقش کلیدی در بروز و توسعه MC12 ایفا می‌کند. این مطالعه بیان کمی IL-4، IL-17 و IFN-γ را که مسیرهای اصلی تمایز سلول‌های CD4+ پس از تحریک آنتی‌ژن هستند، بررسی کرد. در مطالعه ما، در مقایسه با گروه منفی، گروه NPE بیان بالاتری از IL-4، IL-17 و IFN-γ داشت و سطح پروتئین IL-4 و IL-17 نیز بالاتر بود.
از نظر بالینی، بیان mRNAی IL-17 در سلول‌های NP بیماران مبتلا به فتق دیسک افزایش می‌یابد28. افزایش سطح بیان IL-4 و IFN-γ نیز در یک مدل فتق دیسک حاد غیر فشاری در مقایسه با گروه کنترل سالم مشاهده شد29. IL-17 نقش کلیدی در التهاب و آسیب بافتی در بیماری‌های خودایمنی ایفا می‌کند30 و پاسخ ایمنی به IFN-γ31 را افزایش می‌دهد. آسیب بافتی افزایش یافته با واسطه IL-17 در موش‌های MRL/lpr32 و موش‌های مستعد خودایمنی33 گزارش شده است. IL-4 می‌تواند بیان سیتوکین‌های پیش‌التهابی (مانند IL-1β و TNFα) و فعال‌سازی ماکروفاژها را مهار کند34. گزارش شده است که بیان mRNAی IL-4 در گروه NPE در مقایسه با IL-17 و IFN-γ در همان زمان متفاوت بود. بیان mRNAی IFN-γ در گروه NPE به طور قابل توجهی بالاتر از سایر گروه‌ها بود. بنابراین، تولید IFN-γ ممکن است واسطه‌ای برای پاسخ التهابی ناشی از تجمع NP باشد. مطالعات نشان داده‌اند که IFN-γ توسط انواع مختلفی از سلول‌ها، از جمله سلول‌های T کمکی فعال نوع 1، سلول‌های کشنده طبیعی و ماکروفاژها تولید می‌شود35،36، و یک سیتوکین کلیدی پیش‌التهابی است که پاسخ‌های ایمنی را تقویت می‌کند37.
این مطالعه نشان می‌دهد که پاسخ خودایمنی ممکن است در بروز و توسعه MC نقش داشته باشد. لوما و همکارانش دریافتند که ویژگی‌های سیگنال MC و NP برجسته در MRI مشابه هستند و هر دو سیگنال بالایی را در توالی T2W نشان می‌دهند38. ارتباط نزدیک برخی از سیتوکین‌ها با وقوع MC، مانند IL-139، تأیید شده است. ما و همکارانش اظهار داشتند که برآمدگی رو به بالا یا رو به پایین NP ممکن است تأثیر زیادی بر وقوع و توسعه MC12 داشته باشد. بوبچکو40 و هرزبین و همکارانش41 گزارش دادند که NP یک بافت مقاوم به ایمنی است که از بدو تولد نمی‌تواند وارد گردش خون عروقی شود. برآمدگی‌های NP اجسام خارجی را وارد جریان خون می‌کنند و در نتیجه واکنش‌های خودایمنی موضعی را واسطه‌گری می‌کنند42. واکنش‌های خودایمنی می‌توانند تعداد زیادی از عوامل ایمنی را القا کنند و هنگامی که این عوامل به طور مداوم در معرض بافت‌ها قرار می‌گیرند، می‌توانند باعث ایجاد تغییراتی در سیگنالینگ شوند43. در این مطالعه، بیان بیش از حد IL-4، IL-17 و IFN-γ از عوامل ایمنی معمول هستند که رابطه نزدیک بین NP و MCs44 را بیشتر اثبات می‌کنند. این مدل حیوانی به خوبی عبور NP و ورود به صفحه انتهایی را تقلید می‌کند. این فرآیند، تأثیر خودایمنی بر MC را بیشتر آشکار کرد.
همانطور که انتظار می‌رفت، این مدل حیوانی بستری ممکن برای مطالعه‌ی MC در اختیار ما قرار می‌دهد. با این حال، این مدل هنوز محدودیت‌هایی دارد: اولاً، در طول مرحله‌ی مشاهده‌ی حیوانات، برخی از خرگوش‌های مرحله‌ی میانی باید برای آزمایش‌های بافت‌شناسی و زیست‌شناسی مولکولی معدوم شوند، بنابراین برخی از حیوانات به مرور زمان "از رده خارج می‌شوند". ثانیاً، اگرچه سه نقطه‌ی زمانی در این مطالعه تعیین شده است، متأسفانه ما فقط یک نوع MC (تغییر مودیک نوع I) را مدل‌سازی کردیم، بنابراین برای نمایش فرآیند توسعه‌ی بیماری انسان کافی نیست و برای مشاهده‌ی بهتر تمام تغییرات سیگنال، باید نقاط زمانی بیشتری تعیین شود. ثالثاً، تغییرات در ساختار بافت را می‌توان با رنگ‌آمیزی بافت‌شناسی به وضوح نشان داد، اما برخی از تکنیک‌های تخصصی می‌توانند تغییرات ریزساختاری را در این مدل بهتر نشان دهند. به عنوان مثال، از میکروسکوپ نوری قطبی برای تجزیه و تحلیل تشکیل غضروف فیبری در دیسک‌های بین مهره‌ای خرگوش استفاده شد45. اثرات طولانی مدت NP بر MC و صفحه‌ی انتهایی نیاز به مطالعه‌ی بیشتر دارد.
پنجاه و چهار خرگوش سفید نر نیوزیلندی (با وزن حدود ۲.۵ تا ۳ کیلوگرم، سن ۳ تا ۳.۵ ماه) به طور تصادفی به گروه جراحی ساختگی، گروه کاشت عضله (گروه ME) و گروه کاشت ریشه عصب (گروه NPE) تقسیم شدند. تمام مراحل آزمایش توسط کمیته اخلاق بیمارستان تیانجین تأیید شد و روش‌های آزمایش مطابق با دستورالعمل‌های تأیید شده انجام شد.
برخی پیشرفت‌ها در تکنیک جراحی S. Sobajima 46 انجام شده است. هر خرگوش در وضعیت خوابیده به پهلو قرار داده شد و سطح قدامی پنج دیسک بین مهره‌ای کمری (IVD) متوالی با استفاده از روش خلفی-جانبی خلفی-صفاقی نمایان شد. به هر خرگوش بیهوشی عمومی داده شد (20% اورتان، 5 میلی‌لیتر بر کیلوگرم از طریق ورید گوش). یک برش پوستی طولی از لبه پایینی دنده‌ها تا لبه لگن، 2 سانتی‌متر شکمی تا عضلات پاراورتبرال ایجاد شد. ستون فقرات قدامی-جانبی راست از L1 تا L6 با تشریح تیز و کند بافت زیر جلدی پوشاننده، بافت خلفی-صفاقی و عضلات نمایان شد (شکل 6A). سطح دیسک با استفاده از لبه لگن به عنوان یک نقطه عطف آناتومیکی برای سطح دیسک L5-L6 تعیین شد. از یک سوزن سوراخ کننده شماره 16 برای ایجاد سوراخی در نزدیکی صفحه انتهایی مهره L5 تا عمق 3 میلی‌متر استفاده کنید (شکل 6B). از یک سرنگ ۵ میلی‌لیتری برای آسپیراسیون هسته پالپوزوس اتولوگ در دیسک بین مهره‌ای L1-L2 استفاده کنید (شکل ۶C). هسته پالپوزوس یا عضله را طبق الزامات هر گروه بردارید. پس از عمیق‌تر شدن سوراخ ایجاد شده، بخیه‌های قابل جذب روی فاسیای عمقی، فاسیای سطحی و پوست زده می‌شود و مراقب باشید که در حین جراحی به بافت پریوستی جسم مهره آسیبی نرسد.
(الف) دیسک L5-L6 از طریق رویکرد خلفی-جانبی خلفی-صفاقی نمایان می‌شود. (ب) با استفاده از یک سوزن شماره ۱۶، سوراخی در نزدیکی صفحه انتهایی L5 ایجاد می‌شود. (ج) سلول‌های بنیادی مزانشیمی اتولوگ برداشت می‌شوند.
بیهوشی عمومی با تزریق 20% اورتان (5 میلی‌لیتر بر کیلوگرم) از طریق ورید گوش انجام شد و رادیوگرافی ستون فقرات کمری در هفته‌های 12، 16 و 20 پس از عمل تکرار شد.
خرگوش‌ها با تزریق عضلانی کتامین (25.0 میلی‌گرم بر کیلوگرم) و پنتوباربیتال سدیم داخل وریدی (1.2 گرم بر کیلوگرم) در هفته‌های 12، 16 و 20 پس از جراحی کشته شدند. کل ستون فقرات برای تجزیه و تحلیل بافت‌شناسی برداشته شد و تجزیه و تحلیل واقعی انجام شد. از رونویسی معکوس کمی (RT-qPCR) و وسترن بلات برای تشخیص تغییرات در فاکتورهای ایمنی استفاده شد.
معاینات MRI در خرگوش‌ها با استفاده از یک آهنربای بالینی 3.0 تسلا (GE Medical Systems، فلورانس، SC) مجهز به یک گیرنده کویل اندام متعامد انجام شد. خرگوش‌ها با 20٪ اورتان (5 میلی‌لیتر بر کیلوگرم) از طریق ورید گوش بی‌هوش شدند و سپس به پشت در داخل آهنربا قرار گرفتند، به طوری که ناحیه کمری روی یک کویل سطحی دایره‌ای با قطر 5 اینچ (GE Medical Systems) متمرکز شده بود. تصاویر محلی‌سازی شده با وزن T2 کرونال (TR، 1445 میلی‌ثانیه؛ TE، 37 میلی‌ثانیه) برای تعیین محل دیسک کمری از L3-L4 تا L5-L6 گرفته شد. برش‌های وزن T2 صفحه ساژیتال با تنظیمات زیر گرفته شدند: توالی اسپین-اکو سریع با زمان تکرار (TR) 2200 میلی‌ثانیه و زمان اکو (TE) 70 میلی‌ثانیه، ماتریس؛ میدان دید 260 و هشت محرک؛ ضخامت برش 2 میلی‌متر، فاصله 0.2 میلی‌متر بود.
پس از گرفتن آخرین عکس و کشتن آخرین خرگوش، دیسک‌های ساختگی، دیسک‌های عضلانی و دیسک‌های NP برای بررسی بافت‌شناسی برداشته شدند. بافت‌ها به مدت ۱ هفته در فرمالین بافر خنثی ۱۰٪ تثبیت شدند، سپس با اتیلن دی آمین تترا استیک اسید کلسیم‌زدایی شده و برش‌های پارافینی تهیه شدند. بلوک‌های بافتی در پارافین قرار داده شده و با استفاده از میکروتوم به برش‌های ساژیتال (ضخامت ۵ میکرومتر) برش داده شدند. برش‌ها با هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) رنگ‌آمیزی شدند.
پس از جمع‌آوری دیسک‌های بین مهره‌ای از خرگوش‌ها در هر گروه، RNA کل با استفاده از ستون UNIQ-10 (شرکت بیوتکنولوژی شانگهای سانگون، چین) طبق دستورالعمل سازنده و یک سیستم رونویسی معکوس ImProm II (شرکت Promega، مدیسون، ویسکانسین، ایالات متحده آمریکا) استخراج شد. رونویسی معکوس انجام شد.
RT-qPCR با استفاده از Prism 7300 (Applied Biosystems Inc., USA) و SYBR Green Jump Start Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) طبق دستورالعمل سازنده انجام شد. حجم واکنش PCR 20 میکرولیتر بود و حاوی 1.5 میکرولیتر cDNA رقیق شده و 0.2 میکرومولار از هر پرایمر بود. پرایمر‌ها توسط OligoPerfect Designer (Invitrogen, Valencia, CA) طراحی و توسط Nanjing Golden Stewart Biotechnology Co., Ltd. (China) تولید شدند (جدول 1). شرایط چرخه حرارتی زیر استفاده شد: مرحله فعال‌سازی اولیه پلیمراز در دمای 94 درجه سانتیگراد به مدت 2 دقیقه، سپس 40 سیکل 15 ثانیه‌ای در دمای 94 درجه سانتیگراد برای دناتوراسیون الگو، اتصال به مدت 1 دقیقه در دمای 60 درجه سانتیگراد، گسترش و فلورسانس. اندازه‌گیری‌ها به مدت 1 دقیقه در دمای 72 درجه سانتیگراد انجام شد. تمام نمونه‌ها سه بار تکثیر شدند و مقدار میانگین برای آنالیز RT-qPCR استفاده شد. داده‌های تکثیر با استفاده از FlexStation 3 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) تجزیه و تحلیل شدند. بیان ژن‌های IL-4، IL-17 و IFN-γ نسبت به کنترل درون‌زا (ACTB) نرمال‌سازی شد. سطوح بیان نسبی mRNA هدف با استفاده از روش 2-ΔΔCT محاسبه شد.
پروتئین کل با استفاده از هموژنایزر بافت در بافر لیز RIPA (حاوی کوکتل مهارکننده پروتئاز و فسفاتاز) از بافت‌ها استخراج شد و سپس به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتیگراد با سرعت 13000 دور در دقیقه سانتریفیوژ شد تا بقایای بافت حذف شود. پنجاه میکروگرم پروتئین در هر لاین بارگذاری شد، با 10٪ SDS-PAGE جدا شد و سپس به غشای PVDF منتقل شد. بلوک‌بندی در شیر خشک بدون چربی 5٪ در محلول نمکی بافر Tris (TBS) حاوی 0.1٪ Tween 20 به مدت 1 ساعت در دمای اتاق انجام شد. غشا با آنتی‌بادی اولیه خرگوش ضد دکورین (رقیق شده 1:200؛ بوستر، ووهان، چین) (رقیق شده 1:200؛ بایوس، پکن، چین) به مدت یک شب در دمای 4 درجه سانتیگراد انکوبه شد و در روز دوم واکنش نشان داد. با آنتی‌بادی ثانویه (ایمونوگلوبولین G ضد خرگوش بز با رقت ۱:۴۰۰۰۰) همراه با پراکسیداز ترب کوهی (بوستر، ووهان، چین) به مدت ۱ ساعت در دمای اتاق. سیگنال‌های وسترن بلات با افزایش کمی‌لومینسانس روی غشای کمی‌لومینسانس پس از تابش اشعه ایکس شناسایی شدند. برای تجزیه و تحلیل چگالی‌سنجی، لکه‌ها با استفاده از نرم‌افزار BandScan اسکن و کمی‌سازی شدند و نتایج به صورت نسبت واکنش‌پذیری ایمنی ژن هدف به واکنش‌پذیری ایمنی توبولین بیان شدند.
محاسبات آماری با استفاده از بسته نرم‌افزاری SPSS16.0 (SPSS، ایالات متحده) انجام شد. داده‌های جمع‌آوری‌شده در طول مطالعه به صورت میانگین ± انحراف معیار (میانگین ± انحراف معیار) بیان و با استفاده از آنالیز واریانس با اندازه‌گیری‌های مکرر یک‌طرفه (ANOVA) برای تعیین تفاوت بین دو گروه تجزیه و تحلیل شدند. P < 0.05 از نظر آماری معنی‌دار در نظر گرفته شد.
بنابراین، ایجاد یک مدل حیوانی از MC با کاشت نانوذرات اتولوگ در جسم مهره و انجام مشاهدات ماکروآناتومیکی، آنالیز MRI، ارزیابی بافت‌شناسی و آنالیز بیولوژیکی مولکولی می‌تواند به ابزاری مهم برای ارزیابی و درک مکانیسم‌های MC انسانی و توسعه مداخلات درمانی جدید تبدیل شود.
نحوه استناد به این مقاله: هان، سی. و همکاران. یک مدل حیوانی از تغییرات مودیک با کاشت هسته پالپوزوس اتولوگ در استخوان زیر غضروفی ستون فقرات کمری ایجاد شد. Sci. Rep. 6, 35102: 10.1038/srep35102 (2016).
وایشاپت، دی.، زانتی، ام.، هودلر، جی.، و بوس، ان. تصویربرداری رزونانس مغناطیسی ستون فقرات کمری: شیوع فتق دیسک و احتباس آن، فشردگی ریشه عصب، ناهنجاری‌های صفحه انتهایی و آرتروز مفصل فاست در داوطلبان بدون علامت. میزان. رادیولوژی 209، 661-666، doi:10.1148/radiology.209.3.9844656 (1998).
کیائر، پی.، کورشولم، ال.، بندیکس، تی.، سورنسن، جی. اس.، و لبوف-اید، کی. تغییرات مودیک و ارتباط آنها با یافته‌های بالینی. مجله اروپایی ستون فقرات: نشریه رسمی انجمن ستون فقرات اروپا، انجمن اروپایی بدشکلی ستون فقرات، و انجمن اروپایی تحقیقات ستون فقرات گردنی 15، 1312–1319، doi: 10.1007/s00586-006-0185-x (2006).
کوئیسما، م. و همکاران. تغییرات مودیک در صفحات انتهایی مهره‌های کمری: شیوع و ارتباط آن با کمردرد و سیاتیک در کارگران مرد میانسال. ستون فقرات 32، 1116–1122، doi:10.1097/01.brs.0000261561.12944.ff (2007).
دی روس، آ.، کرسل، اچ.، اسپریتزر، ک.، و دالینکا، ام. ام آر آی تغییرات مغز استخوان در نزدیکی صفحه انتهایی در بیماری دژنراتیو ستون فقرات کمری. AJR. مجله رادیولوژی آمریکا 149، 531-534، doi: 10.2214/ajr.149.3.531 (1987).
مودیک، ام تی، استاینبرگ، پی ام، راس، جی اس، ماساریک، تی جی، و کارتر، جی آر. بیماری دیسک دژنراتیو: ارزیابی تغییرات مغز استخوان مهره با ام آر آی. رادیولوژی 166، 193-199، doi:10.1148/radiology.166.1.3336678 (1988).
مودیک، ام تی، ماساریک، تی جی، راس، جی اس، و کارتر، جی آر. تصویربرداری از بیماری دژنراتیو دیسک. رادیولوژی 168، 177-186، doi: 10.1148/radiology.168.1.3289089 (1988).
جنسن، تی‌اس، و همکاران. پیش‌بینی‌کننده‌های تغییرات سیگنال صفحه انتهایی مهره‌ای جدید (مودیک) در جمعیت عمومی. مجله ستون فقرات اروپا: انتشار رسمی انجمن ستون فقرات اروپا، انجمن اروپایی بدشکلی ستون فقرات و انجمن اروپایی تحقیقات ستون فقرات گردنی، بخش 19، 129-135، doi: 10.1007/s00586-009-1184-5 (2010).
آلبرت، اچ‌بی و مانیچ، کی. تغییرات مودیک پس از فتق دیسک کمری. مجله اروپایی ستون فقرات: انتشار رسمی انجمن ستون فقرات اروپا، انجمن اروپایی بدشکلی ستون فقرات و انجمن اروپایی تحقیقات ستون فقرات گردنی 16، 977-982، doi: 10.1007/s00586-007-0336-8 (2007).
Kerttula، L.، Luoma، K.، Vehmas، T.، Gronblad، M.، و Kaapa، E. تغییرات نوع I مودیک می‌تواند دژنراسیون دیسک تغییر شکل سریع پیشرونده را پیش‌بینی کند: یک مطالعه آینده‌نگر 1 ساله. مجله اروپایی ستون فقرات 21، 1135–1142، doi: 10.1007/s00586-012-2147-9 (2012).
هو، زی‌جی، ژائو، اف‌دی، فانگ، ایکس‌کیو و فن، اس‌دبلیو. تغییرات مودیک: علل احتمالی و سهم آن در انحطاط دیسک کمری. فرضیه‌های پزشکی 73، 930-932، doi: 10.1016/j.mehy.2009.06.038 (2009).
کروک، HV پارگی دیسک داخلی. مشکلات افتادگی دیسک بیش از 50 سال. ستون فقرات (Phila Pa 1976) 11، 650-653 (1986).